慢性阻塞性肺疾病患者血清調節性T細胞與PD-1+T細胞的協同抑制效應

汪自然 鄭吼真 劉仕欣 陳 瑞 廖文華 林 琳

(廣州市增城區人民醫院呼吸內科，廣東 廣州 511300)

慢性阻塞性肺疾病患者血清調節性T細胞與PD-1+T細胞的協同抑制效應

汪自然 鄭吼真1劉仕欣 陳 瑞1廖文華1林 琳1

(廣州市增城區人民醫院呼吸內科，廣東 廣州 511300)

目的 探討在慢性阻塞性肺疾病(COPD)中調節性T細胞(Treg)PD-1+T細胞、效應T細胞功能的特征及其之間的相關性。方法 采用流式細胞術分析COPD患者及健康人外周血中Treg、效應T細胞的比例；分析相關細胞因子干擾素(IFN)-γ，白細胞介素(IL)-17水平。體外抑制實驗檢測Treg細胞免疫抑制能力，阻斷PD-1后檢測T細胞產生細胞因子的能力。流式細胞術與酶聯免疫吸附(ELISA)檢測血漿中促炎和免疫抑制細胞因子的產生情況。結果 相比健康人群，COPD患者外周血中Treg細胞水平與表達PD-1的失能效應T細胞水平都升高。COPD患者外周血中Treg產生的細胞因子，包括IL-10、轉化生長因子(TGF)-β都升高。在COPD患者外周血中，通過抑制T細胞的PD-1可以導致T細胞產生IFN-γ與TGF-β的能力顯著上升。結論 在COPD患者中，免疫抑制細胞Treg與失能的PD-1+T細胞會導致效應T細胞的功能失調。

Treg細胞；慢性阻塞性肺疾病；PD-1

慢性阻塞性肺疾病(COPD)的病因目前認為與吸煙、粉塵、空氣污染、呼吸道感染等有關。在COPD病程中，由細菌與病毒相關的慢性與急性感染可以誘導炎癥，對COPD的病理進程有重要作用〔1〕。病毒與細菌對COPD中的淋巴細胞激活具有重要作用，包括Th1與CD8+T細胞介導的適應性免疫反應〔2，3〕。調節性T細胞(Treg)是CD4+T細胞的一個亞群，通過釋放免疫抑制性細胞因子〔如白細胞介素(IL)-10、轉化生長因子(TGF)-β等〕在控制炎癥性的免疫應答與效應T細胞功能中起著重要作用〔4，5〕。在許多種類的炎癥疾病中都發現了Treg數目的變化〔6～9〕。關于Treg細胞在COPD、肺部疾病、外周血中的報道目前很少，特別是關于在COPD中Treg的功能研究。PD-1是效應T細胞上的一個負向調控共刺激分子，在持續的炎癥性免疫應答中表達會上調，通過與之配體相互作用，抑制外周組織中的持續免疫反應，并且阻止自身組織受到免疫損傷〔10〕；PD-1還通過上調IL-10誘導凋亡，引起效應T細胞的功能失調，從而破壞免疫應答〔11，12〕。本文探討在COPD中Treg細胞功能失調是否與表達PD-1的效應T細胞有關。

1 材料與方法

1.1 血樣本 肝素化的外周血樣本來自于95例固定的COPD患者，男50例，女45例，年齡30～82歲，平均(50.7±7.3)歲；文化程度：初高中53例，大學及以上42例；均符合 2006年版COPD全球倡議(GOLD)中關于COPD 的診斷標準。另有健康者35例為對照組，年齡32～85歲，平均(52.4±7.8)歲；文化程度：初高中18例，大學及以上17例。COPD患者均有超過10年的煙齡，在抽血實驗期間病情沒有惡化，沒有其他肺部疾病等，能夠正常完成研究調查。對照組為不吸煙者，肺部功能正常，沒有氣管方面的疾病。本研究經倫理委員會審核批準且實驗者簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 T細胞培養基：RPMI-1640培養基，10%FBS (Gibco 900-108)，青霉素/鏈霉素溶液 (Gibco 15140-122)，2-巰基乙醇 (Invitrogen 21985-023)。流式細胞學檢查儀器：分析儀器：BD LSRFortessa；分選儀器：BDFACSAria Ⅱ；流式熒光抗體購于biolegend公司。ELISA檢測試劑盒購自eBioscience公司。SYBR Green：TAKARA公司。流式細胞學檢查數據分析軟件采用Flowjo Version 9。

1.3 外周血單細胞懸液制作 外周血單核細胞采用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare，Uppsala，Sweden) 分離，進行密度梯度離心〔13〕。

1.4 流式細胞術樣品制備 將分離得到的細胞置于1 ml T細胞培養基中，加入50 ng/ml PMA和1 μg/ml離子霉素，在37℃培養箱中刺激0.5 h后加入 2 μmol/L莫能菌素，繼續培養4 h。流式細胞術抗體標記：(1)表面抗體標記：將細胞重懸在100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)中，按照1×106細胞加0.6 μl流式抗體，置于4℃冰箱中避光孵育25 min，用2 ml PBS洗1～2次。(2)細胞質中細胞因子與細胞核內轉錄因子的標記：使用Ebioscience公司胞質與核固定液，按照說明書進行固定和標記。

1.5 Treg細胞抑制實驗 流式細胞術分選出效應T細胞(CD4+CD25-CD127+)，用3 μg或6 μg無內毒素的P6脂蛋白進行刺激，然后加入或者不加入流式細胞術分選出的自體的Treg細(CD4+CD25+CD127-)。效應T細胞與Treg細胞的比例為2∶1，然后觀察淋巴細胞的增殖情況〔14〕。

1.6 RT-PCR檢測 將分離得到的細胞提取RNA，反轉錄成CDNA，用SYBR Green 進行熒光定量PCR檢測。

1.7 統計學分析 使用Graph Pad Prism 5.0軟件行非配對t檢驗。

2 結 果

2.1 COPD患者外周血中的免疫抑制細胞表達升高 COPD患者外周血中CD4+FOXP3+比例明顯升高，從8.95%±1.05%上升到12.1%±1.53%，CD4+CD25+CD127-FOXP3+Treg細胞比例也明顯增多由3.83%±0.62%升到7.93%±0.81%；Treg細胞的總數也有明顯增高(P<0.001)。

2.2 COPD患者Treg細胞對效應T細胞有更強的抑制作用 COPD患者相比健康人群PD-1+CD127+T細胞的比例(COPD組：23.97%±4.72%，健康人群9.36%±2.84%)與表達強度(COPD組：82.58±9.35,健康人群43.68±7.54)明顯升高(P<0.001)。通過免疫抑制實驗，分選COPD患者與健康人群外周血效應T細胞(CD4+CD127+CD25-)，用3 μg/ml或者6 μg/ml的脂蛋白P6進行刺激。將效應T細胞分別培養于自體的Treg細胞(CD4+CD127-FOXP3+)。效應T細胞與Treg細胞的比例為2∶1。在兩個濃度的P6處理下，COPD患者的效應T細胞增殖能力比健康者差；同時，COPD患者的效應T細胞被Treg細胞抑制的程度也更高(65%及61%)，相比于健康者(44%及40%)差異顯著(P<0.05)。

2.3 COPD患者細胞因子分泌失調 IL-10(COPD組113.73±12.93，健康人群13.98±2.55)與TGF-β(COPD組98.35±11.89，健康人群47.36±6.95)的表達量在COPD患者中都有顯著性增加(P<0.001)。促炎作用的Th1細胞相關的細胞因子包括IFN-γ(COPD組：56.63±15.48，健康人群43.27±6.39)和IL-12(COPD組59.94±7.69，健康人群33.48±4.85)，在COPD患者中也顯著升高(P<0.01)。

2.4 阻斷免疫檢測點后T細胞的功能特性變化 加入抗PD-1抗體后，IFN-γ與TGF-β的分泌都明顯升高(P<0.05)。而IL-17與IL-10的分泌沒有明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1 阻斷免疫檢測點后T細胞的功能特性變化檢測(n=25)

與對照組比較：1)P<0.05;與加入抗原組比較：2)P<0.05

3 討 論

本研究提示在COPD患者中，發揮免疫抑制作用的Treg細胞與失能的PD-1+T細胞是導致效應T細胞功能失調的主要兩個因素。先前報道了Treg細胞在肺部、支氣管肺泡灌洗液(BAL)、外周血中的研究〔15～18〕，但是關于Treg細胞在COPD中研究的報道還較少。

本文通過FOXP3與CD25來確定抑制性的Treg細胞，并且發現在COPD中的Treg細胞具有很強的抑制性功能，能夠抑制自體的效應T細胞的免疫反應。有研究報道，在慢性吸煙的老鼠模型中發現，抑制效應T細胞的功能可以保護老鼠的肺部避免受損〔19〕。本研究也說明在COPD中的Treg細胞具有雙重作用，一方面Treg細胞可以抑制細胞調節的免疫反應，這些免疫反應往往帶來有害的炎癥并且導致發??；另一方面Treg細胞會抑制效應T細胞調節的免疫反應，從而使病癥持續。所以，COPD患者抗菌免疫力被兩個重要的因素所限制：一個是效應T細胞的無能，無法對細菌抗原產生應答；另一個是持續增加的Treg細胞。效應T細胞中增加PD-1的表達是其導致免疫失能的很重要的一個因素，在用PD-1的阻斷抗體后，效應T細胞的功能有了很大的提高。

本研究證實了在COPD患者中免疫抑制的Treg細胞有顯著的積累，它們可能在肺部中抵消產生炎癥的免疫應答。COPD患者中的效應T細胞被抑制，一方面被Treg細胞抑制，另一方面呈現出失能的表型，從而減弱其抗病毒和抗菌的效應功能，阻斷了PD-1后顯著增加了效應T細胞的免疫應答。因此，PD-1+細胞可以作為一個新的靶標來治療COPD而找到清除病癥產生炎癥反應的效應細胞與減輕炎癥反應的免疫抑制細胞之間的平衡，對于治療COPD將大有裨益。

1 Sethi S，Murphy TF.Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.N Engl J Med，2008；359：2355-65.

2 Barnes PJ.Chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.N Engl J Med，2000；343：269-80.

3 O′Donnell R，Breen D，Wilson S，etal.Inflammatory cells in the airways in COPD〔J〕.Thorax，2006；61：448-54.

4 Abe Y，Murphy TF，Sethi S，etal.Lymphocyte proliferative response to P6 of Haemophilus influenzae is associated with relative protection from exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2002；165：967-71.

5 Lan RY，Ansari AA，Lian ZX，etal.Regulatory T cells：development，function and role in autoimmunity〔J〕.Autoimmun Rev，2005；4：351-63.

6 Yu QT，Saruta M，Avanesyan A，etal.Expression and functional characterization of FOXP31 CD41 regulatory T cells in ulcerative colitis〔J〕.Inflamm Bowel Dis，2007；13：191-9.

7 Sitohy B，Hammarstr?m S，Danielsson A，etal.Basal lymphoid aggregates in ulcerative colitis colon：a site for regulatory T cell action〔J〕.Clin Exp Immunol，2008；151：326-33.

8 Ruprecht CR，Gattorno M，Ferlito F，etal.Coexpression of CD25 and CD27 identifies FoxP3+ regulatory T cells in inflamed synovia〔J〕.J Exp Med,2005；201：1793-803.

9 van Oosterhout AJ，Bloksma N.Regulatory T-lymphocytes in asthma〔J〕.Eur Respir J,2005；26：918-32.

10 Boussiotis VA，Chatterjee P，Li L.Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications〔J〕.Cancer J，2014;20(4)：265-71.

11 Hotchkiss RS，Opal S.Immunotherapy for sepsis-a new approach against an ancient foe〔J〕.N Engl J Med,2010；363：87-9.

12 Benson DM Jr，Bakan CE，Mishra A，etal.The PD-1/PD-L1 axis modulates the natural killer cell versus multiple myeloma effect：a therapeutic target for CT-011，a novel monoclonal anti-PD-1 antibody〔J〕.Blood，2010;116(13)：2286-94.

13 Suresh K，Fraser G，Scheid E，etal.Generation of in vitro B-CLL specific HLA class I restricted CTL responses using autologous dendritic cells pulsed with necrotic tumor lysate〔J〕.Leuk Lymphoma,2006；47：297-306.

14 Abe Y，Murphy TF，Sethi S，etal.Lymphocyte proliferative response to P6 of Haemophilus influenzae is associated with relative protection from exacerbations of chronic obstructive pulmonary disease〔J〕.Am J Respir Crit Care Med,2002；165：967-71.

15 Smyth LJ，Starkey C，Vestbo J，etal.CD4-regulatory cells in COPD patients〔J〕.Chest,2007；132：156-63.

16 Brandsma CA，Hylkema MN，Geerlings M，etal.Increased levels of (class switched)memory B cells in peripheral blood of current smokers〔J〕.Respir Res,2009；10：108.

17 Barceló B，Pons J，Ferrer JM，etal.Phenotypic characterisation of T-lymphocytes in COPD：abnormal CD41CD251 regulatory T-lymphocyte response to tobacco smoking〔J〕.Eur Respir J,2008；31：555-62.

18 Lee SH，Goswami S，Grudo A，etal.Antielastin autoimmunity in tobacco smoking-induced emphysema〔J〕.Nat Med,2007；13：567-9.

19 Podolin PL，Foley JP，Carpenter DC，etal.T cell depletion protects against alveolar destruction due to chronic cigarette smoke exposure in mice〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2013；304：L312-23.

〔2017-01-06修回〕

(編輯 滕欣航)

廣東省自然科學基金(No.2016A030313666)

汪自然(1970-)，男，碩士，主治醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究。

R56

A

1005-9202(2017)11-2642-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.018

1 中山大學孫逸仙紀念醫院呼吸內科