磷脂酰肌醇3激酶p55γ調節亞基N末端氨基酸表達水平對人乳腺癌細胞的影響及分子機制

張雪蓮 胡光瑞

(白城醫學高等專科學校基礎醫學部生化教研室，吉林 白城 137000)

磷脂酰肌醇3激酶p55γ調節亞基N末端氨基酸表達水平對人乳腺癌細胞的影響及分子機制

張雪蓮 胡光瑞1

(白城醫學高等專科學校基礎醫學部生化教研室，吉林 白城 137000)

目的 探討磷脂酰肌醇3激酶p55γ調節亞基N末端氨基酸表達水平對人乳腺癌細胞黏附性的影響及其分子機制。方法 使用空載體質粒pEGFP-C和重組質粒pEGFP-N24分別對乳腺癌SK-BR-3細胞進行基因轉染，建立融合蛋白GFP-N24和GFP穩定表達的SK-BR-3細胞系。顯微鏡下觀察轉染細胞的形態變化并鑒定轉染細胞中的蛋白表達；細胞黏附實驗檢測細胞的黏附性；Western印跡法檢測轉染細胞的細胞黏附分子E-cadherin和鈣緊張素表達；酶譜實驗檢測基質金屬蛋白酶(MMP)和尿激酶纖溶酶原活化因子(uPA)表達。結果 建立了穩定表達GFP-N24的SK-BR-3/pEGFP-C細胞系和表達GFP的SK-BR-3/pEGFP-C細胞系，GFP-N24的表達量明顯高于 GFP。 SK-BR-3/GFP-N24細胞在纖黏連蛋白和鼠尾膠原上的黏附性均明顯低于SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C細胞(P<0.01)。SK-BR-3/GFP-N24細胞E-cadherin蛋白表達量明顯高于SK-BR-3/pEGFP-C細胞和SK-BR-3細胞，鈣緊張素蛋白表達量明顯低于SK-BR-3/pEGFP-C和SK-BR-3細胞(P<0.01)。SK-BR-3/pEGFP-C與SK-BR-3細胞之間E-cadherin和鈣緊張素蛋白的表達量差異無統計學意義(P>0.05)；3組細胞上清液中均檢測到分子量為79 kD的MMP和60 kD的uPA，且MMP、uPA表達量3組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 磷脂酰肌醇3激酶p55γ調節亞基N末端氨基酸過表達是通過影響E-cadherin和Wnt通路關鍵分子鈣緊張素表達來抑制人乳腺癌SK-BR-3細胞的胞黏附性來實現的。

磷脂酰肌醇3激酶；乳腺癌；細胞黏附；E-cadherin；鈣緊張素

磷脂酰肌醇3激酶可介導細胞內多個信號通路，調控細胞生長、增殖，與癌細胞的發生發展密切相關〔1〕；其p55γ調節亞基N末端結構域不僅能與膠質母細胞瘤蛋白結合調控細胞周期，還可與增殖細胞核抗原結合促進脫氧核糖核酸合成以及腫瘤發生〔2〕。p55γ調節亞基N末端24個氨基(N24)過表達可顯著抑制乳腺癌、胃癌、結腸癌等多種癌細胞的活性〔3〕。本文旨在探究p55γ調節亞基N末端過表達對人乳腺癌細胞黏附性的影響，進而分析其對乳腺癌細胞遷移、侵襲能力的潛在作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 乳腺癌細胞系SK-BR-3購于上海斯信生物科技有限公司；空載體質粒pEGFP-C和重組質粒pEGFP-N24(含磷脂酰肌醇3激酶p55γ調節亞基N末端24個氨基酸cDNA，在EcoRⅠ和BamH Ⅰ酶切位點植入pEGFP載體而成)均購于上海芃碩生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因轉染細胞系構建 取對數生長期的SK-BR-3細胞分為兩組，轉染前24 h接種至6孔板中，培養至細胞覆蓋面積>80%，取4～6 μg的空載體質粒pEGFP-C、重組質粒pEGFP-N24分別進行基因轉染，36 h后用含500 mg/L G418的DMEM培養液進行抗性克隆株的篩選，構建穩定轉染細胞系后記為SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3/pEGFP-N24，將細胞用胰蛋白酶消化后按1×106/孔密度接種于6孔板中，孵育48 h后光學顯微鏡下觀察細胞形態；Western印跡法鑒定蛋白表達。

1.2.2 細胞黏附實驗 分別用3 g/L牛血清白蛋白、30 mg/L纖黏連蛋白、25 ng/L鼠尾膠原包被96孔板，37℃孵育3 h，4℃過夜。在包被不同基質的細胞培養孔中按1×105/孔密度分別接種SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3/GFP-N24細胞，每組設置3個復孔，培養4 h后洗去未黏附的細胞。黏附細胞經10%甲醛固定20 min，結晶紫染色5 min，磷酸緩沖液漂洗，1%十二烷基苯磺酸鈉溶解30 min，以590 nm波長處讀取吸光度值為細胞黏附指標。

1.2.3 細胞黏附分子E-cadherin和Wnt通路關鍵分子表達檢測 采用Western印跡法進行檢測，分別提取SK-BR-3、SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C細胞總蛋白，BCA蛋白定量后行SDS-PAGE電泳，濕法轉膜，室溫封閉3 h；滴加E-cadherin多克隆抗體(1∶500稀釋)、鈣緊張素單克隆抗體(1∶1 000稀釋)、β-actin單克隆抗體(1∶1 000稀釋)，4℃過夜，5%TBST清洗后滴加二抗(1∶1 000稀釋)，室溫靜置1 h，洗凈后行ECL顯色。ChemiDoc MP 多功能成像系統掃描雜交條帶。

1.2.4 酶譜實驗 按1×106/孔密度在6孔板中分別接種SK-BR-3、SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C細胞，無血清培養24 h后取上清行SDS-PAGE電泳；在分離膠配置過程中，基質金屬蛋白酶(MMP)實驗加1%明膠至終濃度0.1%；尿激酶纖溶酶原活化因子(uPA)實驗加10 mg/L纖溶酶原和1 g/L的酪蛋白。電泳完成后用蒸餾水沖洗電泳膠，3%聚乙二醇辛基苯基醚中室溫輕搖2 h。沖洗后分別轉入明膠酶緩沖液和甘氨酸緩沖液中，37℃反應10 h，Coomassie brilliant blue R250染色6 h，脫色至出現負染帶。

1.3 統計學分析 組間比較行t檢驗。

2 結 果

2.1 轉染細胞形態學變化和蛋白表達情況 光學顯微鏡下觀察SK-BR-3細胞為圓形或梭形，平鋪式生長；基因轉染后SK-BR-3細胞形態逐漸變為扁平的長梭形，尤其是表達GFP-N24的細胞形態變為成纖維形且胞質中存在大量分泌顆粒，見圖1。Western印跡檢測顯示，在SK-BR-3細胞裂解液中未出現蛋白條帶，兩組基因轉染后的細胞中可見蛋白條帶，融合蛋白GFP-N24的表達量為(6.39±0.51)，明顯高于空載體中的(2.76±0.18)(P<0.01)。見圖2。

圖1 pEGFP轉染對SK-BR-3細胞形態的影響

圖2 3組細胞中GFP-N24蛋白表達情況

2.2 GFP-N24過表達對SK-BR-3細胞黏附的影響 3組細胞在牛血清白蛋白上的黏附性比較差異無統計學意義(P>0.05)；SK-BR-3/ GFP-N24細胞在纖黏連蛋白和鼠尾膠原上的黏附性均明顯低于SK-BR-3、SK-BR-3/pEGFP-C細胞(P<0.01)。見表1。

表1 3組細胞黏附實驗結果比較

與SK-BR-3組比較：1)P<0.01；與SK-BR-3/pEGFP-C組比較：2)P<0.01

2.3 GFP-N24過表達對E-cadherin和鈣緊張素表達的影響 SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3細胞中E-cadherin蛋白表達量分別為(3.95±0.42)、(2.18±0.20)、(2.03±0.09)，鈣緊張素蛋白表達量分別為(2.46±0.38)、(2.95±0.52)、(1.21±0.16)。GFP-N24過表達的SK-BR-3細胞E-cadherin蛋白表達量明顯高于轉染空載體細胞和SK-BR-3細胞，鈣緊張素蛋白表達量明顯低于轉染空載體細胞和SK-BR-3細胞(P<0.01)。轉染空載體細胞與SK-BR-3細胞之間E-cadherin蛋白和鈣緊張素蛋白表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3。

2.4 GFP-N24過表達對MMP和uPA表達的影響 3組細胞上清液中均有檢測到分子量為79 kD的MMP和60 kD的uPA，SK-BR-3/GFP-N24、SK-BR-3/pEGFP-C、SK-BR-3細胞MMP表達量分別為(9.25±1.48)、(9.06±1.13)、(8.93±1.85)，uPA表達量分別為(4.01±1.62)、(4.18±1.93)、(4.11±1.40)。3組細胞中MMP、uPA表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖3 3組細胞中E-cadherin和鈣緊張素蛋白表達情況

圖4 酶譜法檢測3組細胞中MMP和uPA表達情況

3 討 論

乳腺癌的發生與PI3K信號通路的持續激活密切相關，p55γ可通過調節催化亞基的生物學活性，影響亞細胞定位來調控PI3K的活性，其還可繞過PI3K/Akt信號通路來發揮特有的細胞生物學功能〔4〕。在胃癌中，p55γ通過NF-κB信號通路提升HIF-1α表達，抑制VEGF表達，進而促進胃癌組織的血管生成〔2〕。本次研究成功構建了穩定表達 GFP-N24的乳腺癌細胞系，觀察發現細胞形態由初始的平鋪式生長轉變為成纖維形，胞質中分泌大量顆粒。相關研究發現，GFP-N24過表達可抑制癌細胞的遷移與侵襲能力，因細胞遷移與黏附之間相互關聯，當癌細胞間黏附力降低時會誘發癌細胞脫離原發瘤組織，而癌細胞與胞外基質、脈管內皮細胞之間黏附能力增加是腫瘤侵襲的關鍵〔5〕。本次研究顯示，GFP-N24過表達可降低SK-BR-3細胞在纖黏連蛋白和膠原上的黏附性，削弱細胞經胞外基質和脈管內皮細胞的遷徙、侵襲力。細胞黏附因子E-cadherin高表達被證實為抑癌轉移因素，本次研究中GFP-N24過表達可提升SK-BR-3細胞E-cadherin表達量，提升癌細胞與正常組織細胞間的黏附性，同時還可下調Wnt信號通路關鍵因子鈣緊張素的表達，最終抑制Wnt/鈣緊張素信號通路，兩者共同作用從而有效抑制癌細胞的轉移。MMP是胞外基質降解、重建的關鍵酶，可消除細胞遷移屏障，有研究發現癌細胞轉移能力與自身分泌MMP的能力呈正相關〔7〕。uPA可降解胞外基質，誘導纖溶酶原轉變為具有活性的纖溶酶，其可直接介導纖黏蛋白、降解膠原或間接作用于MMP相關的侵襲〔7〕。MMP和uPA在癌細胞胞外基質降解中起到協調作用，uPA表達上調是PI3K影響細胞侵襲力的主要因素，但本研究發現GFP-N24過表達對SK-BR-3細胞MMP和uPA表達及分泌無明顯影響，其具體原因和機制仍需進一步研究。

1 劉 偉.磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路在中耳膽脂瘤發病機制中的作用研究〔D〕.長沙：中南大學，2012.

2 李冬霞，蔡曉燕，高建芝，等.乳腺癌組織中乳腺癌1號基因啟動子甲基化狀態與蛋白表達的關系〔J〕.中國老年學雜志，2016；36(13)：3195-6.

3 叢 佳，馮悅年.早期乳腺癌前哨淋巴結活檢術的臨床評價〔J〕.中國衛生工程學，2016；(6)：618-9.

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5 Wen P，Quan Z，Rongwen Xi,etal.The biological function of the WD40 repeat-containing protein p55/Caf1 in Drosophila〔J〕.Developmental dynamics：an official publication of the American Association of Anatomists，2012；241(3)：455-64.

6 Biernatowska A，Podkalicka J，Majkowski M，etal.The role of MPP1/p55 and its palmitoylation in resting state raft organization in HEL cells〔J〕.Biochimica et Biophysica Acta Molecular Cell Res，2013；1833(8)：1876-84.

7 李 振，周愛軍，孫書峰，等.乳腺癌四個分子亞型與腋窩淋巴結轉移的相關性研究〔J〕.北華大學學報(自然科學版)，2015；16(3)：338-41.

〔2017-01-16修回〕

(編輯 郭 菁)

張雪蓮(1984-)，女，講師，主要從事生化教學及實驗研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2654-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.023

1 吉林大學中日聯誼醫院