miRNA-126在支氣管哮喘中的表達及臨床意義

穆清爽 張 慧 汪文娟 薄聰聰 黎 靜

(新疆醫科大學第二附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830063)

miRNA-126在支氣管哮喘中的表達及臨床意義

穆清爽 張 慧 汪文娟 薄聰聰 黎 靜

(新疆醫科大學第二附屬醫院，新疆 烏魯木齊 830063)

目的 探討檢測miRNA-126基因在支氣管哮喘患者及健康者外周血中的表達及在哮喘急性加重期的臨床意義。方法 哮喘急性加重期患者24例為哮喘組，健康志愿者24例為對照組。留取外周血標本，采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測miRNA-126基因的表達，分析其表達差異情況以及與白細胞介素(IL)-6細胞炎癥因子、嗜酸性細胞、IgE的關系，受試者工作特征曲線(ROC)特征評價miRNA-126基因對支氣管哮喘診斷的預測價值。結果 兩組miRNA-126相對含量差異有統計學意義(Z=-2.444，P=0.015)。哮喘組IL-6、嗜酸性細胞、IgE比率顯著高于對照組(P<0.01)。miR-126在支氣管哮喘患者血漿中ROC曲線下面積(AUC)為0.294，診斷價值較低。結論 miRNA-126在哮喘急性加重期患者外周血中表達，呈下調狀態，可能通過輔助T細胞(Th)2優勢應答，使炎性細胞因子升高，有可能成為治療哮喘的新靶點。

miRNA-126；哮喘

目前研究發現miRNAs在哮喘中具有重要作用，也能用于哮喘基因個體易患性判斷〔1〕。其中miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能減少輔助T細胞(Th)2反應、氣道高反應性、嗜酸性細胞聚集，弱化氣道黏液分泌，從而抑制哮喘炎癥產生〔2〕。本研究旨在探討mRNA-126在支氣管哮喘患者急性發作期血漿中的表達水平及其意義。

1 資料與方法

1.1 對象 哮喘組為2015年3～9月新疆醫科大學第二附屬醫院住院部就診的哮喘急性加重期患者血標本24例，其中男10例，女14例，年齡21～52歲，中位年齡38歲。診斷和病情分級符合2014年中華醫學會呼吸分會哮喘組制定的專家共識診療規范。對照組為新疆醫科大學在校學生，其中男12例，女12例，年齡21～23歲，對照組無過敏性鼻炎及呼吸道感染史。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集 采集研究對象的空腹靜脈血5 ml，30 min內3 000 r/min離心5 min分離血清，置于5 ml離心管中，于4℃條件下16 000 r/min離心10 min，吸出上清液置新的離心管中，置-80℃冰箱低溫保存。

1.2.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒(miRNeasy Mini kit，QIAGEN公司)，逆轉錄試劑盒 (miScript II RT Kit，QIAGEN公司)，RT-PCR試劑盒(miScript SYBR?Green PCR kit，QIAGEN 公司)。主要儀器:美國ABI 7300Real Time PCR System擴增儀。

1.2.3 血漿總RNA的提取和RT-PCR (1)提取總RNA：用超微量核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度，RNA濃度和純度在260/280 nm 下檢測，在1.9～2.20 之間。(2)逆轉錄合成cDNA：反應體系20 μl：HIFlex Buffer 4 μl，Nucleics Mix 2 μl，RT Enzyme Mix 2 μl，Total RNA(濃度約20 ng/μl)+ RNase-Free 水共12 μl。(3)實時熒光定量PCR反應(RT-PCR)：引入MiR-126特異性引物(貨號：ms00003430)反應體系25 μl：Quantitect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，miScript Primer Assay 2 μl，miScript Universal Primer 2 μl，RNase-Free 水10 μl，模板cDNA 1 μl。反應條件：95℃ 15 min，1個循環；94℃ 15 s，55℃ 45 s，70℃ 30 s，35個循環。每個樣本做3個復孔，在相同反應條件下同時檢測MiR-126的擴增情況，程序運行后數據分析用Rotor-Gene Q Series Software軟件，最后得出各樣本的熔解曲線、擴增曲線及Ct值。(4)結果檢測與分析：△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，miRNA-126的相對含量為2-ΔΔCt。

1.3 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行秩和檢驗、p檢驗。

2 結 果

2.1 兩組血漿miRNA-126的表達水平 miRNA-126在哮喘組和對照組的相對含量分別為(351 540.000±464 095.000)和(568 670.000±459 555.400)，兩組比較差異有統計學意義(Z=-2.444，P=0.015)。

2.2 兩組外周血炎性因子比較 與對照組比較，哮喘組中IL-6細胞炎癥因子、嗜酸性細胞、IgE水平顯著升高(P<0.01)。見表1。

表1 兩組外周血炎性因子比較

2.3 miRNA-126水平在哮喘診斷中的靈敏度、特異度 受試者工作特征(ROC)曲線分析，miR-126在支氣管哮喘患者血漿中ROC曲線下面積(AUC)為0.294 (95%CI0.130～0.459)，診斷價值較低。見圖1。

圖1 血漿miRNA-126濃度的ROC曲線分析

3 討 論

哮喘是以持續氣道炎癥、氣道高反應性和氣道重塑為特征的慢性呼吸道疾病，是呼吸科最常見的慢性呼吸道疾病之一。因為其發病機制迄今尚未完全闡明，所以，目前治療手段尚不能完全阻止氣道重塑和急性發作。研究認為炎性細胞因子網絡失衡在支氣管哮喘的發病機制中起著重要作用，Th1/Th2細胞因子平衡學說是最早被提出的與免疫相關的支氣管哮喘炎癥發病機制學說〔3〕。Th2優勢分化免疫應答釋放Th2型細胞因子增多，加重嗜酸性粒細胞氣道炎癥，導致哮喘急性發作〔4〕，miRNA-126能抑制哮喘的表型，并能減少Th2反應、氣道高反應性、嗜酸性細胞聚集和黏液過度分泌，針對哮喘氣道高反應的miRNA治療可達到抗炎癥的目的〔5〕。在慢性遷延性哮喘小鼠模型中，氣道內miRNA-126表達顯著升高，在慢性激發期下調miRNA-126，能減輕氣道內嗜酸性粒細胞浸潤，改善哮喘的癥狀〔6〕。

單個microRNA能和數百種靶向基因結合，通過對靶基因轉錄后的調控機制，參與炎性疾病及免疫異常相關疾病的調節，是負反饋調節的重要調控因子。miRNA-126通過多種途徑調節免疫系統參與哮喘的炎癥反應過程。miRNA-126 在氣道管壁細胞中依賴髓樣分化因子(MyD)88和Toll樣受體(TLR)4 表現出上調趨勢，通過 miRNA拮抗劑抑制miRNA-126高表達后，抑制Th2 細胞釋放IL-5 和IL-13炎性細胞因子，氣道黏液分泌量呈減弱趨勢，從而減輕哮喘急性發作癥狀〔7，8〕。

在哮喘氣道炎癥的產生過程中，IgE是介導Ⅰ型超敏反應的重要物質，IgE 通過與其受體結合發揮作用，當抗原在與機體再次接觸后，激活IgE復合物受體，借助肥大細胞、嗜酸性粒細胞等炎癥細胞的表面Fc受體〔9〕，并被T細胞受體識別，從而激活Th亞群，釋放IL-2、IL-4、IL-6、IL-13等炎性因子。本研究推測miRNA-126下調可能通過調節Th平衡，造成Th2優勢應答，使B淋巴細胞增殖分泌IgE，導致嗜酸性粒細胞及炎性介質IL-6增高。而盧蘭等〔10〕研究表明miRNA-126在哮喘患者中高表達，并可能通過調節TSLP 調控Th2 細胞的優勢分化、Th2 型細胞因子水平參與哮喘的調控機制。

本研究采用RT-PCR法檢測，在空間表達分辨率、準確性、靈敏度、特異度方面較之基因芯片技術和Northern 雜交技術有無法比擬的優勢〔11〕，實驗過程順利，嚴格按照操作說明進行，出現與既往研究結論不一致可能與樣本量較少有關，是否在Th細胞的反應中，有其他關鍵miRNA影響靶mRNA發揮作用尚不明確。本研究樣本量少，單一基因表達診斷價值低，需聯合其他miRNAs診斷。

1 Baumjohann D，Ansel KM.MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity〔J〕.Nat Rev Immunol，2013；13(9)：666-78.

2 Sullivan CS，Grundhoff AT，Tevethia S，etal.SV40-encoded microRNAs regulate viral gene expression and reduce susceptibility to cytotoxic T cells〔J〕.Nature，2005;435(7042)：682-6.

3 Mattes J，Collison A，Plank M，etal.Antagonism of microRNA-126 suppresses the effector function of Th2 cells and the development of allergic airways disease〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，2009;106(44)：18704-9.

4 Ray A，Cohn L.Altering the Th1/ Th2 balance as a therapeutic strategy in asthmatic diseases 〔J〕.Curr Opin Investig Drugs，2000;1(4)：442-8.

5 Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，etal. An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation 〔J〕.Ann Med，2008;40(5)：322-35.

6 Mattes J，Yang M，Mahalingam S，etal.Intrinsic defect in T cell production of interleukin (IL)-13 in the absence of both IL-5 and eotaxin precludes the development of eosinophilia and airways hyper-reactivity in experimental asthma〔J〕.J Exp Med，2002;195(11)：1433-44.

7 Collison A，Herbert C，Siegle JS，etal.Altered expression of microRNA in the airway wall in chronic asthma：miR-126 as a potential therapeutic target 〔J〕.BMC Pulm Med,2011;11(1)：29.

8 Lu TX，Rothenberg ME.Diagnostic，functional，and therapeutic roles of microRNA in allergic diseases〔J〕.J Allergy Clin Immunol，2013;132(1)：3-13.

9 史傳見，呂玉敏，文 川，等.哮喘和慢性肺重疊綜合征患者血清總IgE水平改變及其臨床意義研究〔J〕.臨床肺科雜志，2016；21(2)：283-5,286.

10 盧 蘭，唐漢慶，竇錫彬，等.miRNA-126、TSLP在哮喘患者中的表達及影響〔J〕.醫學信息，2014；(5)：67-8.

11 Schmittgen TD，Lee EJ，Jiang J，etal.Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA〔J〕.Methods，2008;44(1)：31-8.

〔2017-01-09修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

新疆醫科大學科研創新基金項目(No.XYDCX201435)

黎 靜(1963-)，女，副教授，主任醫師,主要從事呼吸系統各類疾病的診治，特別重視基礎理論研究。

穆清爽(1983-)，女，碩士，主治醫師，主要從事支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺癌的診治研究。

R56

A

1005-9202(2017)11-2730-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.057