七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷及對線粒體融合蛋白2表達和PI3K-Akt通路的影響

楊 春，范志強，王建剛，田首元，金弋喬，李 翔，朱 健

·基礎醫學論著/研究·

七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷及對線粒體融合蛋白2表達和PI3K-Akt通路的影響

楊 春1，范志強2，王建剛3，田首元3，金弋喬1，李 翔1，朱 健3

目的 探討七氟醚后處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的保護作用以及其對線粒體融合蛋白2(Mfn-2)的表達和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路的影響。方法 將30只SD大鼠隨機分為5組：S組、MIRI組、SP組、SP+W組、W組，每組6只。麻醉固定大鼠暴露心臟，除外S組，其余4組均結扎左前降支30min，復灌120min，SP組在復灌前10min吸入2.3%七氟醚15 min，SP+W組在吸入前股靜脈注射稀釋的渥曼青霉素1 mL，W組則只在復灌前靜注渥曼青霉素。結束后檢測指標：ELISA法測cTn-I，蛋白免疫印跡法檢測總Akt、P-Akt、Mfn-2的表達，電鏡下觀察心肌細胞形態學變化。結果 各組總Akt接近，差異無統計學意義(P>0.05)。與S組相比較，其他各組cTn-I含量、P-Akt表達上調，差異有統計學意義；與SP組比較，MIRI組、SP+W組、W組cTn-I表達上調，P-Akt表達下調，差異均有統計學意義(P<0.05)；MIRI組、SP+W組、W組組間cTn-I、P-Akt表達接近，差異無統計學意義。與S組相比較，其他各組Mfn-2表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)；SP組與SP+W組Mfn-2表達差異無統計學意義(P>0.05)，MIRI組與W組Mfn-2表達差異無統計學意義(P>0.05)；與SP組、SP+W組比較，MIRI組與W組Mfn-2表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)。電鏡下顯示S組無受損跡象，SP組明顯較MIRI組、SP+W組、W組損傷減輕。結論 七氟醚后處理通過下調Mfn-2表達進而激活PI3K-Akt通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

七氟醚后處理；心肌缺血再灌注損傷；線粒體融合蛋白2；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶

在應對心血管事件中，重新恢復血流有時會造成一個新的加重心臟損害，多引起細胞凋亡，稱之為缺血再灌注損傷(MIRI)[1]。其區別于急性心肌梗死[2]。有文獻證實七氟醚可以減輕這一損傷[3]。七氟醚在臨床上廣泛使用[4]，對于心肌保護具有良好的便利性。其中涉及線粒體融合蛋白2(Mfn-2)[5]和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)這一信號轉導通路[6]。線粒體融合蛋白2是線粒體外膜上高度保守的鳥苷三磷酸(GTP)酶，是線粒體外膜上非常重要的蛋白之一，除外已知的調控線粒體形態，還介導細胞的凋亡，該蛋白具有雙向性，有文獻發現其既具有抗凋亡的作用，同時又證實該蛋白也促進凋亡。Mfn-2作用與細胞種類和細胞狀態有關[7]。目前，有文獻發現Mfn-2在大鼠心肌細胞中的作用表現為促進凋亡[8]。人和大鼠有95%的同源性[7]，因此本次試驗選取大鼠作為實驗動物。PI3K-Akt通路通過對下游靶蛋白進行磷酸化從而抑制細胞凋亡、抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性阻止凋亡級聯反應的激活，還有促進P53降解等途徑，發揮其在心肌細胞凋亡中的保護作用[9]。然而對于這兩個保護因素是否處于同一路徑，誰又在機制上游，少有報道。故本課題擬研究七氟醚在心肌缺血再灌注損傷中的保護作用，探討Mfn-2表達和PI3K-Akt通路的作用及兩者的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 七氟醚(批號：H20070172，上海恒瑞)，20%烏拉坦溶液(山西醫科大學生理實驗室)，Wortmannin與稀釋液(上海拜力生物科技有限公司)，肌鈣蛋白I(cTn-I) ELISA試劑盒(Bio-Swamp ELISA Reagents)，Akt、Mfn-2試劑盒(abcam)P-Akt試劑盒(CST)，大鼠用呼吸機(型號HX-300)，七氟醚揮發器(Vapor 2000七氟醚專用蒸發器 )，透射電鏡(JEM-1011，JEOL)，離心機、測吸光度、繪制標準曲線等其余檢測儀器或技術支持均由山西醫科大學生理實驗室提供。

1.2 動物選取與分組 30只健康雄性SD大鼠，體重200 g～300 g，由北京市海淀興旺動物養殖場提供，許可證號[SCXK-20140013]，利用計算機軟件隨機分為5組：手術組(S組)、缺血再灌注組(MIRI組)、七氟醚后處理組(SP組)、七氟醚后處理+PI3K-AKT通道抑制劑Wortmannin組(SP+W組)、抑制劑Wortmannin組(W組)，每組6只。

1.3 模型的制備 腹腔注射20%的烏拉坦(4 mL/kg)麻醉禁食12 h的大鼠，隨后用絲線和醫用膠布將大鼠的門齒和四肢分別固定于37 ℃恒溫臺，使其呈四肢外展的水平仰臥位。將心電圖電極聯于大鼠肢體(分別聯于左右上肢及右下肢)，并開始記錄Ⅱ導心電圖，取樣保存。隨后將頸部氣管暴露，切開氣管，并將調節好的動物呼吸機(頻率設定為40次/min，潮氣量為1.4 mL～2.1 mL，具體為每增加1 kg體重增加7 mL，吸呼比設置為1∶3，避免非常規量呼吸對心臟損傷的影響)[10]，將氣管導管插入氣管，并用絲線系緊，絲線起固定導管，封閉導管與氣管間隙作用。于胸骨左緣在3～4肋間處，觸摸到心臟最強搏動，此處備皮，沿肋間鈍性分離肌肉，擴胸器支撐下暴露心臟，輕輕除去外層心包膜，確認左前降支后，用絲線穿過該血管下方(6-0帶線圓針，深度約為2 mm，進針口與出針口跨度約為4 mm)，待心電圖穩定后，適當力度結扎，觀察心電圖ST段動向，以Ⅱ導聯中抬高>0.1 mV或T波高尖為有效[11]，選取有代表性波形。開始計時，結扎時間為30 min，過程中觀察心臟是否有變暗紅色的區域，則該區域為左前降支供血區域。其中S組絲線只穿過而不結扎，其余各組結扎左前降支30 min后，復灌120 min，依據心電圖ST段變化(抬高的ST段和T波應該有回落)和心臟顏色變化(變暗紅區域顏色有所恢復)確定建立成功的大鼠心肌缺血再灌注損傷模型。SP組在結扎20 min時(即復灌前10 min)通過呼吸機吸入1MAC(2.3%)七氟醚持續15 min，SP+W組在吸入七氟醚前通過股靜脈注射給15 μg/kg的Wortmannin稀釋液1 mL；W組則只在復灌前靜注Wortmannin。其中Wortmannin為PI3K-Akt通道抑制劑。整個實驗過程采用濕潤生理鹽水紗布覆蓋傷口，以減少大鼠體液揮發與體溫散失。

1.4 測量指標

1.4.1 取樣檢測指標 復灌后隨即開腹，采血針穿刺進入腹主動脈，抽取新鮮動脈血液入促凝采血管靜置待血液凝固后離心(離心10 min，轉速為3 000 r/min)用微量槍取上清液分裝到EP管(塑料離心管)于-20 ℃保存后，實驗后期測量cTn-I含量。另外將左前降支供血的變色心尖部剪下，用生理鹽水沖洗干凈后置于標本袋，一小部分(每塊≈1 mm3、三四塊)固定包埋固化切片染色用于后期透射電鏡下觀察心尖缺血組織的亞細胞結構損傷情況，剩余在-80 ℃保存用于Western Blot法檢測P-Akt、總Akt的含量，并計算其比值，檢測Mfn-2蛋白的表達情況。

1.4.2 血清中cTn-I含量檢測 酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定血清中cTn-I含量，具體步驟按照所購試劑盒說明書操作。解凍EP管中的血清樣品，用一系列濃度梯度的標準品制作含量與吸光值的標準曲線，通過檢測出的樣本吸光值來逆推各樣品的cTn-I含量。

1.4.3 心肌組織中Akt、磷酸化的Akt即被激活的Akt(P-Akt)、Mfn-2的表達，蛋白免疫印跡法檢測心肌組織中Akt、P-Akt、Mfn-2的表達 取存于-80 ℃冰箱的心肌組織，稱重、剪碎、以1∶10的比例加入裂解液、以13 000 r/min離心15 min取上清液BCA法測蛋白濃度。完成配膠、電泳分離蛋白，以marker確定目標蛋白位置、轉膜、洗膜、封閉液室溫封閉、孵一抗、孵二抗后，使用ECL化學發光即用型底物顯影曝光，分析目標蛋白灰度值，并用各自的內參(本內參為GAPDH)校正。

1.4.4 透射電鏡下觀察心肌組織切片中心肌細胞超微結構的損傷情況 2.5%戊二醛、0.1 mol/L磷酸緩沖液、1%鋨酸固定液用以固定。一定濃度的乙醛、丙酮用以包埋。隨后固化切片，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，電鏡下觀察心尖缺血組織的亞細胞結構損傷情況。

2 結 果

2.1 各組檢測指標比較 各組總Akt接近，GAPDH接近，差異無統計學意義，表明各樣本上樣量基本一致。與S組比較，其余各組cTn-I含量、P-Akt/總Akt、Mfn-2表達明顯升高，差異有統計學意義。與SP組比較，MIRI組、SP+W組、W組cTn-I表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)；MIRI組、SP+W組、W組P-Akt/總Akt升高，差異有統計學意義(P<0.05)；MIRI組、SP+W組、W組間cTn-I、P-Akt/總Akt差異均無統計學意義。SP組、SP+W組之間Mfn-2表達差異無統計學意義，MIRI組、W組之間Mfn-2表達差異無統計學意義，SP組、SP+W組Mfn-2表達低于MIRI組、W組，差異有統計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 各組檢測指標比較(±s)

2.2 電鏡下觀察心肌組織切片中心肌細胞形態學 S組線粒體結構清晰完整；MIRI組、SP+W組、W組可觀察到細胞呈濃縮現象，核染色質濃縮、集邊現象，部分細胞可見線粒體腫脹、嵴斷裂甚至空泡現象；SP組凋亡現象較MIRI組、SP+W組、W組減少。

3 討 論

MIRI防治的研究一直是醫學熱點。受制于倫理，本實驗借用大鼠MIRI模型，來評價七氟醚這一保護現象，雖然結果明確，但是其中仍有許多問題需要被探索闡明。Mfn-2的功能較多，而其在細胞凋亡中的作用是難點之一，或抑制凋亡，或促進凋亡，具體原因尚未明了。雖然已知PI3K-Akt通路受上游的Mfn-2影響[12]，但七氟醚影響的PI3K-AKT通路還受什么因素影響尚未知[13]。同時，測量指標中的cTn-I在人類中由心肌細胞受損后肌鈣蛋白復合物釋放入血明顯升高一般在4 h～6 h后[14]，而大鼠心肌損傷后不到1 h即可差異性檢出(P<0.05)，在第3小時就可達到高峰[15]，也體現了二者之間存在種屬差異，甚至同在七氟醚關于大鼠某些細胞凋亡中，性別差異也會影響結果[16]。結合文獻，正式實驗之前的預實驗證實了1MAC七氟醚的確有保護效果[17]，受實驗規模限制，對于不同梯度濃度的七氟醚，保護有多大的差異性，還是未知。更重要的是心肌的缺血再灌注損傷導致的細胞凋亡是一個比較長的過程[18]，本實驗只進行了對早期的觀察，后期的一些變化未能充分展示，七氟醚對整個凋亡過程的影響還需要深入挖掘。

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(本文編輯郭懷印)

The Effects of Mfn-2 Expression and PI3K-Akt Signaling Pathway in Reduction of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury by Sevoflurane Postconditioning in Rats

Yang Chun，Fan Zhiqiang，Wang Jiangang，Tian Shouyuan，Jin Yiqiao，Li Xiang，Zhu Jian

Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Fan Zhiqiang (Shanxi Boai Hospital，Taiyuan 030001，Shanxi，China)

Objective To research the protection function of myocardial ischemia-reperfusion injury by sevoflurane postconditioning in rats and the role of Mfn-2 expression and PI3K-Akt signaling pathway.Methods Thirty Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups (n=6 earch)：group S，group MIRI，group SP，group SP+W，and group W. After anesthesia and fix the rats，except group S，the rest of the four groups would be ligation tight the left anterior descending branches for 30 minutes，then renew blood flow for 120 minutes. Group SP should inhale 2.3% sevoflurane for 15 minutes，when it is 10 minutes before the blood flow renewed. Group SP + W should be given a 15 μg/kg diluented Wortmannin for 1 mL by vein injection before inhalation. Group W was given the diluented Wortmannin only before the blood flow renewed.Then cTn -I was measured by ELISA.The total Akt，P - Akt and Mfn - 2 expression were measured by western blot.The ratio of the P - Akt and total Akt was calculated.The morphology changes of myocardial cell were observed under electron microscopy. Results The total Akt was closed in 5 groups，there was no statistically significant difference(P>0.05).Compared with group S，cTn -I and P-Akt/total Akt were increased statistically significantly in group MIRI，group SP，group SP+W，and group W(P<0.05). cTn-I in group SP was less than that in group MIRI，group SP+W，and group W(P<0.05). P-Akt and P-Akt/total Akt in group SP was more than that in group MIRI，group SP+W，and group W(P<0.05). There was no significant difference in aspects of cTn-I，P-Akt/total Akt among group SP+W，group MIRI and group W(P>0.05). Compared with group S，Mfn-2 were increased in the others(P<0.05). There was no significant difference in Mfn-2 between group SP and group SP+W(P>0.05).Neither the difference between group MIRI and group W，but the former two groups were smaller than the latter ones，there was a significant difference(P<0.05).It showed that there was no signs of damage in group S，while it shows a significantly damage lighter in group SP than other three groups with the electron microscope.Conclusion Sevoflurane postconditioning can alleviate myocardial ischemia-reperfusion injury in rats，probably via with the reduction of Mfn-2 expression and the activation of PI3K - Akt pathway，also，the former factor effects the latter one.

sevoflurane postconditioning；myocardial ischemia-reperfusion injury；Mfn-2；PI3K - Akt

山西省自然科學基金面上項目(No.2014011040-9)

1.山西醫科大學(太原 030001)；2.山西博愛醫院；3.山西醫科大學第一醫院

范志強，E-mail：fankm@163.com

信息：楊春，范志強，王建剛，等. 七氟醚后處理減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷及對線粒體融合蛋白2表達和PI3K-Akt通路的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(10)：1174-1177.

R542.2 R256.2

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.10.007

1672-1349(2017)10-1174-04

2016-12-01)