分子印跡磁固相萃取/氣相色譜法分析環境水樣中5種酰胺類除草劑殘留

孫日晗，王 濤，王 曉，，紀文華*

(1.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；2.山東省科學院，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

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分子印跡磁固相萃取/氣相色譜法分析環境水樣中5種酰胺類除草劑殘留

孫日晗1，王 濤2，王 曉1，2，紀文華2*

(1.山東農業大學 食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；2.山東省科學院，山東省分析測試中心，山東省中藥質量控制技術重點實驗室，山東 濟南 250014)

以丁草胺為假模板分子，丙烯酰胺為功能單體，利用四氧化三鐵磁性納米微球成功制備了具有特異性識別能力的磁性分子印跡聚合物。采用透射電子顯微鏡、紅外光譜和振動樣品磁強計對印跡聚合物進行表征，結果顯示，分子印跡聚合物成功包裹在四氧化三鐵表面。印跡聚合物對5種酰胺類除草劑均有特異性識別作用。以磁性分子印跡聚合物為基礎，建立了酰胺類除草劑的氣相色譜檢測方法。方法學驗證表明該方法具有良好的回收率(85.0%～99.5%)和精密度(RSD為2.8%～5.0%，n=5)，線性范圍為0.1～500 μg·L-1，檢出限為0.02～0.05 μg·L-1。該方法能夠應用于農田灌溉用水等環境水樣的測定。

酰胺類除草劑；磁性分子印跡聚合物；磁固相萃取；吸附性能；氣相色譜

酰胺類除草劑是目前生產中應用較為廣泛的一類芽前除草劑，其除草效果較好，但具有較高的殘留毒性，美國環境保護局已將乙草胺定為B-2類致癌物[1]。由于酰胺類除草劑的水溶性較高且易于淋溶，而土壤吸附常數又相對較低，所以施到農田的酰胺類除草劑易通過滲透轉移到淺層地下水或隨雨水徑流進入地表水。歐盟規定環境水和飲用水中單個除草劑的最大殘留量不超過0.1 μg·L-1，總除草劑的最大殘留量不超過0.5 μg·L-1[2]，因此對酰胺類除草劑的分析檢測極為重要。目前酰胺類除草劑的檢測方法主要有色譜法[3- 4]、色譜-質譜聯用法[5-9]、酶聯免疫吸附分析法[10]，但這些方法的前處理主要采用傳統的固相萃取或液液萃取，特異性差，易導致大量基質共萃取而影響目標分析物的測定。因此建立一種快速、高效的酰胺類除草劑分析方法具有重要意義。

磁性分子印跡固相萃取是近年快速發展起來的樣品前處理技術，廣泛應用于食品檢測[11]、生物分離[12]、環境檢測[13]等領域。磁性分子印跡聚合物(MMIPs)是融合磁性粒子特性與分子印跡技術的一種新型分離材料，它同時具有磁性粒子的磁響應性和分子印跡聚合物(MIPs)對目標分子的特定識別力與親和力[14-18]。利用磁性粒子的特性，在外加磁場作用下可使聚合物達到快速富集，相比于傳統固相萃取技術，該方法省去了復雜的離心過程，提高了聚合物的可控性。因此，將磁性分子印跡聚合物應用于固相萃取已得到學術界的廣泛關注[19-21]。

本課題組在前期研究中，采用新的合成方法在四氧化三鐵表面直接包裹功能單體和交聯劑，成功制備了環烯醚萜苷磁性分子印跡聚合物[22]。本文利用該方法合成了酰胺類除草劑分子印跡聚合物，并將其作為磁性固相萃取材料應用于水質中酰胺類除草劑的檢測，進而建立了一種基于磁性分子印跡固相萃取(MMISPE)的氣相色譜(GC)快速檢測方法。該方法目標化合物的回收率較高，重現性良好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

布魯克VERTEX 70紅外光譜儀(美國，比勒利卡)，SQUID VSM 磁強計(美國量子設計公司)，JEM-2010F 透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)，FeCl3·6H2O(科密歐試劑公司)，檸檬酸鈉(克拉瑪爾試劑公司)，乙酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，5種酰胺類除草劑(乙草胺、丁草胺、丙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺)標準溶液、敵稗、乙二醇、N,N′-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)、丙烯酰胺(AM)和甲基偶氮二異丁腈(AIBN)均購自阿拉丁試劑公司。甲醇和乙腈為色譜純，其余試劑為分析純，實驗用水為去離子二次蒸餾水。

1.2 四氧化三鐵的制備

采用溶劑熱法合成磁性納米粒子，具體步驟如下：將3.6 g FeCl3·6H2O和0.72 g檸檬酸鈉溶解在乙二醇-乙醇(9∶1，體積比)溶劑中，超聲脫氣，再加入4.8 g乙酸鈉，攪拌5 min。將混合液轉入容量為200 mL的水熱合成反應釜中，在200 ℃下反應10 h，得到黑色反應產物，再用乙醇和水將反應產物分別洗3次。最后真空干燥12 h，得到Fe3O4磁性納米粒子。

1.3 MMIPs的制備

在100 mL三頸瓶中加入0.05 g Fe3O4粒子和40 mL乙腈，超聲脫氣后，加入假模板分子丁草胺0.06 g，MBA 0.48 g，AM 0.24 g，AIBN 0.004 g。機械攪拌下回流4 h，聚合反應完成后在外加磁場的作用下分離得到反應產物。將反應產物放入索氏提取器中，用甲醇-乙酸(9 ∶1，體積比)為洗脫劑洗脫24 h以除去模板分子，再用甲醇洗脫除去乙酸，真空干燥24 h即可。空白磁性印跡聚合物(MNIPs)的合成無需添加假模板分子丁草胺，其余方法同上。

1.4 透射電鏡分析

為了研究磁性分子印跡聚合物的結構特征，對 MMIPs 和 MNIPs 進行透射電鏡分析，放大倍數為20 000倍。

1.5 等溫吸附實驗

在10 mL離心管中分別加入10 mg MMIPs和MNIPs，再加入5 mL不同濃度的丁草胺標準溶液(1～60 mg·L-1)，室溫振蕩2 h后，加磁鐵分離聚合物，用GC檢測上清液中丁草胺的含量。采用下式計算吸附量：Qe=(Ci-Ce)V/m，式中，Qe為吸附平衡時MMIPs吸附酰胺類除草劑的量(mg·g-1)；Ci(mg·L-1)和Ce(mg·L-1)分別為吸附前和吸附平衡后溶液中丁草胺的濃度；V(mL)為吸附液體積；m(mg)為聚合物的質量。

1.6 吸附動力學實驗

將10 mg MMIPs加入5 mL 20 mg·L-1的丁草胺標準溶液中，室溫下振蕩100 min，在外加磁場作用下分離聚合物，采用GC檢測上清液中丁草胺的含量，以考察MMIPs對酰胺類除草劑的吸附速率。

1.7 選擇性實驗

將10 mg MMIPs和MNIPs分別置于5 mL 20 mg·L-1的乙草胺、丙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、丁草胺標準溶液和敵稗標準溶液中，室溫振蕩2 h后，磁鐵分離，取上清液用GC檢測其中的乙草胺、丙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、丁草胺和敵稗含量。

1.8 GC色譜條件

色譜柱：DB-5 MS石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm);進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：280 ℃；柱溫：初始溫度:70 ℃，保持1 min，以15 ℃/min 升至200 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至270 ℃，保持12 min；載氣：高純N2，流速：3 mL/min，尾吹氣：30 mL/min；分流比為1∶10，進樣量為1 μL。

2 結果與討論

表1 假模板分子、功能單體以及交聯劑的配比對平衡吸附量(Qe)及印跡因子(α)的影響

2.1 磁性分子印跡聚合物的制備與性能表征2.1.1 磁性聚合物制備條件的優化 采用沉淀聚合法在Fe3O4表面直接包裹分子印跡聚合物，以MBA為交聯劑，AM為功能單體，AIBN為引發劑，丁草胺為假模板分子。其中，假模板分子、功能單體、交聯劑之間的配比直接影響聚合物的印跡效率，所以在制備過程中有必要對三者的配比進行優化(表1)。由表1可知，當三者的質量比為1∶4∶8時，平衡吸附量(Qe)和印跡因子α(α=Qe MMIPs/Qe MNIPs)的值最高。因此選擇在該比例下合成MMIPs和MNIPs。

圖1 MMIPs 的透射電鏡圖Fig.1 TEM image of MMIPs

圖2 Fe3O4與MMIPs的飽和磁滯回線Fig.2 Magnetization curves of Fe3O4 and MMIPs

2.1.2 透射電鏡分析 用透射電鏡對MMIPs的形貌和粒徑進行了考察。由圖1可看出MMIPs的分散性良好，粒徑約為720 nm，可以明顯看到分子印跡層，此種核殼式結構有利于傳質效率的提高。

2.1.4 磁飽和強度分析 由圖2可看出 Fe3O4和 MMIPs的磁飽和強度分別為80.1 emu·g-1和36.2 emu·g-1，說明Fe3O4和MMIPs均具有良好的磁力度。因此，MMIPs可以用于快速磁分離。

2.2 選擇性實驗

利用酰胺類除草劑的結構類似物敵稗來評價MMIPs的特異性吸附性能。結果顯示，MMIPs對乙草胺、丙草胺、異丙草胺、異丙甲草胺、丁草胺均具有較高的吸附量，且與MNIPs對酰胺類除草劑的吸附量差值較大(為1.6～2.1 mg·g-1)，而MMIPs和MNIPs對敵稗的吸附量差值較小(為0.5 mg·g-1)，由此說明MMIPs中存在酰胺類除草劑的特異性識別位點。

2.3 平衡吸附實驗

利用等溫吸附實驗測定MMIPs和MNIPs對丁草胺的吸附量，如圖3A所示，MMIPs和MNIPs的吸附量均隨著丁草胺濃度的增加而增加，但MMIPs對目標分析物的吸附量遠高于MNIPs的吸附量。由此說明MMIPs中存在特異性更強的結合位點。

2.4 吸附動力學實驗

圖3B為MMIPs和MNIPs對20 mg·L-1丁草胺的動態吸附曲線。由圖可以看出，MMIPs對丁草胺有較高的傳質速率，在開始的15 min內即可達最高吸附容量。

2.5 磁固相萃取(MMISPE)條件的優化

2.5.1 吸附劑的用量 考察了不同用量(20～100 mg)的吸附劑MMIPs對5種酰胺類除草劑的吸附效果。結果表明，當吸附劑的用量為60 mg時，目標分析物的回收率最高。因此選擇60 mg為吸附劑的最佳用量。

2.5.2 樣品體積的優化 樣品體積是評價吸附劑吸附低濃度目標分析物的重要影響因素，分別對50～200 mL濃度為20 μg·L-1的5種酰胺類除草劑溶液進行吸附，發現目標物的回收率隨樣品體積在50～100 mL范圍內增加而呈上升趨勢。因此，實驗選擇100 mL為最佳樣品體積。

2.5.3 洗脫液及用量的優化 加入洗脫液的目的是將目標分析物從吸附劑中洗脫。本實驗分別采用甲醇、甲醇-醋酸(98∶2,體積比)、甲醇-醋酸(96∶4 ,體積比)和甲醇-醋酸(94∶6,體積比)為洗脫液進行洗脫，洗脫液用量為1～10 mL。結果顯示，采用4 mL甲醇-醋酸(96∶4)溶液洗脫時，目標分析物的回收率最高。因此，選用4 mL甲醇-醋酸(96∶4)為洗脫溶液。

2.5.4 洗脫時間的優化 考察了不同洗脫時間(3，10，15，20 min)的洗脫效果。結果表明，15 min足以完全洗脫目標分析物。因此，實驗選擇洗脫時間為15 min。

2.6 方法學驗證

將5種酰胺類除草劑標準溶液逐步稀釋，得濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5，1，5，10，100，200，500 μg·L-1的標準溶液，進樣測定，結果發現5種酰胺類除草劑在0.1～500 μg·L-1的濃度范圍內線性關系良好，相關系數(r2)均不小于0.998 3(表2)。以3倍信噪比(S/N=3)時的濃度為檢出限(LOD)，得5種酰胺類除草劑的LOD為0.02～0.05 μg·L-1；S/N=10時的濃度為定量下限(LOQ)，得到5種酰胺類除草劑的LOQ為0.06～0.17 μg·L-1(表2)。

將3種不同濃度水平(1.0，10，20 μg·L-1)的酰胺類除草劑標準溶液添加到不含酰胺類除草劑的地表水、地下水和河水中，分別進行加標回收率實驗，結果見表3。采用MMISPE凈化得的回收率為85.0%～99.5%，相對標準偏差(RSD)為2.8%～5.0%。

表2 5種除草劑的線性關系、LODs、 LOQs及不同添加水平下樣品的回收率

圖4 地下水(a)、地下水加標后(b～d)的磁固相萃取/氣相色譜圖譜Fig.4 MMIP/GC chromatograms of agriculture irrigating water(a) and spiked agriculture irrigating water (b-d) spiked concentrration(b-d):1.0,10,20 μg·L-1；peaks:1.acetochlor；2.metolachlor；3.propisochlor；4.pretilachlor；5.butachlor

2.7 實際樣品的應用

以MMIPs為吸附劑，采用優化后的磁固相萃取方法對農田灌溉水中的目標分析物進行選擇富集，將60 mg MMIPs置于100 mL樣品中吸附15 min，采用4 mL甲醇-醋酸(96∶4)進行洗脫。圖4為原始樣品以及在不同加標水平(1.0，10，20 μg·L-1)下經MMIPs萃取后的樣品氣相色譜圖。分析結果顯示，地下水(農田灌溉用水)經MMIPs萃取，酰胺除草劑不能被檢出。而經MMIPs萃取后不同加標水平下的樣品，目標分析物的色譜峰明顯，可定性定量分析。綜上所述，MMIPs可以用于環境水樣中酰胺類除草劑的富集和分離測定。

3 結 論

本文以丁草胺為假模板分子，AM為功能單體，MBA為交聯劑，采用表面聚合法成功制備了磁性分子印跡聚合物。通過紅外光譜、透射電鏡與磁飽和強度分析，發現該磁性印跡聚合物微球大小均勻，分散性較好，能夠在外加磁場作用下實現快速分離。將該磁性分子印跡聚合物結合氣相色譜用于水質中酰胺類除草劑的檢測，效果理想。

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Analysis of Five Chloroacetamide Herbicides by HPLC with Magnetic Molecularly Imprinted Solid-phase Extraction

SUN Ri-han1，WANG Tao2，WANG Xiao1,2，JI Wen-hua2*

(1.College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Taian 271000,China；2.Shandong Key Laboratory of Quality Control of Chinese Medicine,Shandong Analysis and Test Center,Shandong Academy of Science,Jinan 250014,China)

Magnetic molecularly imprinted polymers(MMIPs) with specific recognition ability were successfully synthesized by using butachlor as template molecule and acrylamide(AM) as functional monomer.MMIPs were characterized by transmission electron microscopy(TEM),infrared spectroscopy(FT-IR) and vibrating sample magnetometry(VSM).The results showed that molecularly imprinted layer was successfully wrapped on the surface of Fe3O4.MMIPs showed a specific recognition for five chloroacetamide herbicides.The developed magnetic molecular imprinted solid phase extraction coupled with gas chromatography(MMISPE/GC) method exhibited a good recovery(85.0%-99.5%),a good precision(RSD:2.8%-5.0%，n=5),a good linearity(0.1-500 μg·L-1) and a low limit of detection(0.02-0.05 μg·L-1) under the optimized conditions.The introduced MMISPE/GC method was successfully used to analyze five chloroacetamide herbicides in environmental water samples.

chloroacetamide herbicides;magnetic molecularly imprinted polymers;magnetic solid phase extraction;adsorption performance;gas chromatography

2017-01-22；

2017-02-26

國家自然科學基金(81603286)；山東省重點研發計劃(2016GSF202033)；山東省科學院先導科技專項；山東省泰山學者崗位專家專項

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.06.008

O657.71；S482.4

A

1004-4957(2017)06-0750-06

*通訊作者：紀文華，助理研究員，研究方向：復雜體系樣品前處理，Tel：0531-82605315，E-mail:jwh519@163.com