丁苯酞對β淀粉樣蛋白誘導新生SD大鼠海馬神經元凋亡的影響

楊宇　賈真　何來鵬　劉廣雁

【摘要】 目的：探討丁苯酞對β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）誘導新生SD大鼠海馬神經元凋亡的保護作用。方法：將培養的大鼠海馬神經元細胞分成Aβ組、Aβ+丁苯酞組和對照組三組，其中Aβ組采用20 μmol/L Aβ處理24 h；Aβ+丁苯酞組先采用10 μmol/L丁苯酞處理30 min后再加入20 μmol/L Aβ處理24 h；對照組不進行任何處理。檢測各組海馬神經元凋亡、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達情況。結果：（1）MTT檢測結果：Aβ組和Aβ+丁苯酞組OD570均顯著低于對照組（P<0.05），Aβ+丁苯酞組OD570顯著高于Aβ組（P<0.05）。Aβ組和Aβ+丁苯酞組相對于對照組的海馬相神經元對存活率分別為48.15%、69.13%。（2）海馬神經元細胞凋亡情況：Aβ組和Aβ+丁苯酞組海馬神經元細胞凋亡率分別為（50.38±5.32）%和（25.87±2.66）%，均顯著高于對照組的（1.24±0.17）%，而Aβ組海馬神經元細胞凋亡率顯著高于Aβ+丁苯酞組（P<0.05）。（3）Western Blotting結果：Aβ組、Aβ+丁苯酞組和對照組iNOS相對表達量分別為（1.92±0.18）、（0.98±0.12）和（0.37±0.08），Aβ組和Aβ+丁苯酞組iNOS相對表達量均顯著高于對照組，Aβ組iNOS相對表達量顯著高于Aβ+丁苯酞組（P<0.05）。結論：丁苯酞能夠有效抑制Aβ造成的大鼠海馬神經元細胞的凋亡作用，降低iNOS表達水平，減少自由基產生和毒性作用。

【關鍵詞】 丁苯酞； β淀粉樣蛋白； 海馬神經元； 凋亡

Effects of Butylphthalide onβ-amyloid Protein Induced Apoptosis in Hippocampal Neurons of Neonatal SD Rats/YANG Yu，JIA Zhen，HE Lai-peng，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（17）：034-037

【Abstract】 Objective：To investigate the protective effect of Butylphthalide onβ-amyloid protein（Aβ） induced apoptosis in hippocampal neurons of neonatal SD rats.Method：Cultured rat hippocampal neuron cells were divided into Aβ group，Aβ+Butylphthalide group and the control group，Aβ group with 20 μmol/L Aβ 24 h，Aβ+Butyphthalide group with 10 μmol/L Butylphthalide treatment 30 min after adding 20 μmol/L Aβ

24 h，the control group without any treatment.The apoptosis of hippocampal neurons and the expression of inducible nitric oxide synthase（iNOS） in three groups were detected.Result：（1） The results of MTT test：OD570 of Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were significantly lower than that of the control group（P<0.05），OD570 of Aβ+Butyphthalide group were significantly higher than that of Aβ group （P<0.05）.Compared with the control group，the survival rate of hippocampal neurons in Aβgroup and Aβ+Butyphthalide group were 48.15% and 69.13%.（2）Hippocampal neurons apoptosis：cell apoptosis rate of hippocampal neurons of Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were （50.38±5.32）% and （25.87±2.66）%，significantly higher than （1.24±0.17）% of the control group，Aβ group was significantly higher than that of Aβ+Butyphthalide group（P<0.05）.（3）Western Blotting results：iNOS relative expression of Aβ group，Aβ+Butyphthalide group and the control group were （1.92±0.18），（0.98±0.12） and （0.37±0.08）， Aβ group and Aβ+Butyphthalide group were significantly higher than that of the control group，Aβ group was significantly higher than that of Aβ+Butyphthalide group（P<0.05）.Conclusion：Butylphthalide can effectively inhibit apoptosis of cells in rat hippocampal neurons caused by Aβ，decrease the expression level of iNOS，reduce the production of free radicals and toxicity.

【Key words】 Butyphthalide； Amyloid beta protein； Hippocampus； Apoptosis

First-authors address：Department of Geriatrics of Guangdong Medical University，Zhanjiang 524000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.17.009

阿爾茨海默癥（Alzheimer disease，AD）是老年癡呆最常見的種類，約占老年癡呆的59%[1]。AD是一種以進行性認知功能減退和日常生活能力下降為臨床表現的神經變性疾病，神經元丟失、神經元纖維纏結和神經元外老年斑等是AD最主要的病理特點[2-3]。老年斑的形成是由于β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，Aβ）在神經元細胞外異常沉積有關，Aβ沉積能夠直接造成神經元細胞死亡，并激活膠質細胞進而釋放炎癥因子，加劇神經變性作用[4-5]。基于此，目前治療AD的重要手段即是采用藥物減少Aβ的產生，并促進已經沉積的Aβ發生降解，主要藥物藥品包括布洛芬、吲哚美辛、17-β雌二醇等[6]。丁苯酞（dl-3-n-butylphthalide）是目前常用的急性缺血性卒中的治療藥物，該藥能夠改善神經元細胞線粒體功能，消除氧自由基，提高細胞內抗氧化酶活性，降低谷氨酸釋放，抑制血小板聚集反應，從而實現改善神經功能減退狀況[7]。已有研究證實，丁苯酞能夠改善AD模型動物認知和記憶功能的作用[8]。本研究旨在深入探討丁苯酞在Aβ誘導新生SD大鼠神經元凋亡的保護機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 選擇出生24 h內的24只SD乳大鼠，雌雄不限，由本院實驗動物中心提供。

1.1.2 試劑 丁苯酞購自石藥集團恩必普藥業有限公司；DMEM/F12培養基、10%胎牛血清、0.25%胰酶消化液、青鏈霉素雙抗混合液以及谷氨酰胺均購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑（MTT）、脂質體2000等購自美國Invitrogen公司；Caspase 3

測定試劑盒、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（ELISA）購自美國R&D公司；抗iNOS抗體購自美國Sigma公司；ECL化學發光試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元細胞培養 取出生24 h內的SD乳大鼠，消毒后在無菌條件下斷頭，取出大鼠雙側海馬組織放入4 ℃預冷的DMEM/F12培養基中，除去腦膜組織和微血管。DMEM/F12培養基清洗2次，手術剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的小塊，加入等體積0.25%胰酶消化液后輕柔吹打，將上清轉移至干凈的PE管中，滴加胎牛血清終止消化。余下懸液于37 ℃培養箱內繼續消化15 min，滴加胎牛血清終止消化，過200目細胞篩，1000 r/min離心5 min保留沉淀，加入DMEM/F12培養基中制成單細胞懸液，立即接種于含有6孔板細胞培養板內，37 ℃、5% CO2培養箱內培養，去除成纖維細胞，將未貼壁細胞接種至細胞瓶內。次日更換為無血清培養基，以后每3天換液一次。

1.2.2 細胞分組和處理 將培養的大鼠海馬神經元細胞分成Aβ組、Aβ+丁苯酞組和對照組三組，每組8只。其中Aβ組采用20 μmol/L Aβ處理24 h；Aβ+丁苯酞組先采用10 μmol/L 丁苯酞處理30 min后再加入20 μmol/L Aβ處理24 h；對照組不進行任何處理。每組獨立實驗重復3次。

1.2.3 MTT法測定海馬神經元存活率 將培養在96孔細胞培養板中的各組大鼠海馬神經元分別予以相應干預24 h后，每孔分別加入180 μL培養基和20 μL 5 g/L的MTT，于37 ℃培養箱內孵育4 h后加入100 μL二甲亞砜溶液，繼續培養15 min后通過酶標儀測定570 nm處吸光值。每組獨立實驗重復3次。

1.2.4 海馬神經元細胞凋亡測定 各組細胞于6孔細胞培養板培養6 d后給予相應處理干預24 h，采用D-Hank溶液清洗細胞2次，10%甲醛固定40 min，沖洗3次，加入含有HO33342染液的D-Hank溶液染色30 min后在熒光顯微鏡下計數至少10個不同視野下神經元細胞凋亡率。每組獨立實驗重復3次。

1.2.5 誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）表達測定 將各組大鼠海馬神經元細胞儀5×105/孔濃度接種至6孔培養板內，給予相應處理培養24 h，棄上清，裂解細胞，離心后收集上清，采用BCA法測定上清中蛋白質濃度。各組取等量蛋白，采用Western Blotting法檢測各組iNOS表達情況，以β-actin作為內參。iNOS表達量采用各組iNOS蛋白條帶與β-actin條帶灰度值之比。每組獨立實驗重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組海馬神經元存活率比較 MTT法檢測各組海馬神經元存活率結果顯示，Aβ組和Aβ+丁苯酞組OD570均顯著低于對照組（P<0.05），Aβ+丁苯酞組OD570顯著高于Aβ組（P<0.05）。Aβ組和Aβ+丁苯酞組相對于對照組的海馬相神經元對存活率分別為48.15%、69.13%。

2.2 各組海馬神經元細胞凋亡比較 Aβ組和Aβ+丁苯酞組海馬神經元細胞凋亡率分別為（50.38±5.32）%和（25.87±2.66）%，均顯著高于對照組的（1.24±0.17）%，而Aβ組海馬神經元細胞凋亡率顯著高于Aβ+丁苯酞組（P<0.05）。

2.3 各組iNOS表達情況比較 Western Blotting結果顯示，Aβ組、Aβ+丁苯酞組和對照組iNOS相對表達量分別為（1.92±0.18）、（0.98±0.12）和（0.37±0.08），Aβ組和Aβ+丁苯酞組iNOS相對表達量均顯著高于對照組，Aβ組iNOS相對表達量顯著高于Aβ+丁苯酞組（P<0.05）。

3 討論

據估計，2015-2030年全球AD患者將達到甚至超過10億人，這對于人類健康是極大的挑戰[9-10]。目前醫學界普遍認為AD最重要的發病原因是Aβ在神經元細胞外異常沉積，進而引起神經元退行性病變。研究表明，AD的發生和進展與神經元細胞凋亡關系密切，并認為神經元細胞凋亡是AD患者神經元退行性病變和死亡的關鍵途徑[11-12]。因此，有學者提出通過控制神經元細胞凋亡來抑制和治療AD[13-14]。本研究結果顯示，Aβ組大鼠海馬神經元細胞存活率顯著低于對照組，細胞凋亡率和iNOS相對表達量均顯著高于對照組；在Aβ處理前采用丁苯酞進行處理30 min，能夠有效提高細胞存活率，降低細胞凋亡率和iNOS相對表達量，表明丁苯酞對于大鼠海馬神經元細胞具有一定的保護作用。iNOS是一種誘導酶，正常條件下表達量極低，在病理條件或者受到嚴重威脅時發生高表達，iNOS半衰期較長，也就意味著iNOS一旦表達則可在較長時間內發揮其活性作用，大量、持續性產生一氧化氮（NO），進而介導一系列細胞毒性作用[15-16]。

研究表明，丁苯酞具有良好的抗腦缺血、血栓形成以及血小板聚集作用，能夠有效改善線粒體功能，清除氧自由基，并可以改善腦缺血區域微循環和血流動力學[17-18]。丁苯酞目前被廣泛應用于癡呆、缺血性腦病等治療。張麗娜等[19]應用丁苯酞治療急性缺血性腦卒中患者，結果表明丁苯酞能夠明顯改善患者認知功能。王偉等[20]建立缺血再灌注腦損傷大鼠模型，研究丁苯酞對模型大鼠海馬神經元的保護作用，結果表明不同劑量丁苯酞均能降低大鼠腦梗死體積，減少海馬組織5-羥色胺陽性細胞數量，提示丁苯酞可能通過降低5-羥色胺的表達實現對海馬神經元的保護作用。

綜上，丁苯酞能夠有效抑制Aβ造成的大鼠海馬神經元細胞的凋亡作用，降低iNOS表達水平，減少自由基產生和毒性作用。

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（收稿日期：2017-03-27） （本文編輯：程旭然）