草莓果腐敗霉菌的分離、鑒定及其防腐方法探索

楊茜然，顧曉穎，張云娟，汪雯，李凌飛

（云南農業大學食品科學技術學院，昆明650201）

草莓果腐敗霉菌的分離、鑒定及其防腐方法探索

楊茜然，顧曉穎，張云娟，汪雯，李凌飛*

（云南農業大學食品科學技術學院，昆明650201）

目的：對草莓果上的腐敗霉菌進行分離鑒定，并探索其防腐方法，為草莓的保鮮、貯藏及深加工過程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依據。方法：采用傳統平板法分離草莓果上的霉菌，通過形態學觀察結合DNA序列分析方法對所分離的菌株進行鑒定。結果：引起草莓果腐敗的霉菌主要是普通青霉（Penicillium commune）、產黃青霉（Penicillium chrysogenum）、奧爾森青霉（Penicillium olsonii）、小刺青霉（Penicillium spinulosum）、土曲霉（Aspergillus terreus）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、深綠木霉（Trichoderma atroviride）、尖小叢殼菌（Glomerella acutata）及擬盤多毛孢（Pestalotiopsis sp.）。同時，采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理結合低溫冷藏技術對草莓果上的微生物進行抑制，結果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏抑菌效果最好。結論：引起草莓果腐敗變質的霉菌主要包括5個屬9個種，其中青霉屬是引起草莓果腐敗變質的優勢菌群。通過比較幾種保鮮方法，表明0.05%的山梨酸溶液處理是一種較為理想的草莓果貯藏保鮮方法。

草莓；霉菌；鑒定；抑制

草莓（Fragaia ananassa Duch.）是薔薇科草莓屬的多年生草本植物。果實色澤鮮艷，果肉柔軟多汁，酸甜可口，老少皆宜，深受消費者喜愛。草莓富含維生素，有機酸以及礦質元素，具有很高的營養價值和食療作用〔1〕，享有“水果皇后”之美譽。草莓果實為漿果，果皮極薄，組織嬌嫩，在采摘后的貯藏運輸過程中極易受到機械損傷；并且草莓含水多，含糖量高，是多種微生物的天然培養基。因此草莓在儲運過程中，極易受到微生物污染，不僅導致草莓快速腐敗變質，也帶來了食用安全問題。目前，國內外對草莓微生物的研究主要集中在草莓栽培過程中一些微生物病害〔2-3〕，關于草莓采后果實上微生物種群組成的研究較少。潘見等〔4〕對采摘后的草莓進行衛生微生物檢查，從中分離到了8科10屬16種細菌。李枝文〔5〕從草莓發酵液中分離到了2株酵母菌。然而，目前對草莓采后腐敗變質的霉菌研究甚少。本研究在傳統微生物分離純化的基礎上，應用形態學方法結合現代分子生物學技術對草莓果上的霉菌進行分類鑒定，同時探討草莓果上腐敗霉菌的抑制方法，從而為草莓的保鮮、貯藏及深加工過程中有目的地控制微生物提供合理有效的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料草莓果分別采自昆明市西山區和玉溪市紅塔區草莓種植基地，隨機抽樣進行檢測。

1.2 霉菌的分離霉菌的分離采用兩種方法：一是按照國標GB 4789.15-2010方法，用孟加拉紅培養基于28℃培養72 h分離草莓果上的霉菌。二是將采來的新鮮草莓果放至自然腐敗變質，從已發霉的草莓果上直接挑取霉菌菌絲進行分離純化。所分離的霉菌用馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA培養基）進行純化后，挑取單菌落進行保存。

1.3 霉菌的分類鑒定

1.3.1 霉菌的形態學觀察根據常用的霉菌鑒定方法，通過觀察霉菌的形態特征，對照《真菌分類學》〔6〕對霉菌進行初步鑒定。

1.3.2總DNA的提取根據形態學初步鑒定的結果，選擇代表菌株，利用CTAB法（石英砂研磨）〔7〕提取真菌基因組DNA。

1.3.3 PCR條件通過真菌通用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）對ITS（包括5.8S）區進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）：2×Premix Taq（TaKaRa）25μL，DNA模板2μL，引物（10μmol∕L）各2μL，去離子水補足至50μL。PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性40 s，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行30個循環，72℃后延伸10 min。

1.3.4 DNA序列分析PCR擴增產物經純化后送至上海生物工程有限公司進行DNA測序。所獲得的DNA序列與GenBank數據庫中的序列進行比對分析。根據比對結果，選取同源性較高的已知菌株的ITS序列和所測菌株的序列一起構建系統發育樹。采用Mega 4.0軟件中鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統發育樹。

1.4 草莓果防腐方法探索將采來的新鮮草莓果采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理后分別在室溫和4℃低溫條件下儲存，每種處理做3個平行，每一平行的樣本數為20顆草莓。每天定時觀察草莓的腐敗變質情況，記錄每一處理中變質草莓果的顆粒數以及外觀變化，利用腐爛率來衡量抑制效果（腐爛率：用累積法統計，以腐爛顆數占果實總數的百分比表示）。見表1。

表1 草莓果的防腐方法

1.5 數據統計分析采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。對于各處理方法的防腐效果比較，兩兩比較采用配對樣本t檢驗、三組及三組以上數據比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 霉菌的形態學特征及其鑒定結果經分離純化，得到9種霉菌單菌落，其形態特征及鑒定結果如下：CF8菌株：在PDA培養基上，菌落局限生長，具幾道同心環或無同心環，無滲出液。產生較多小分生孢子，分生孢子面灰綠色，呈球形或近球形，鏈狀排列，孢壁平滑；分生孢子梗壁光滑，帚狀枝雙輪生，叉開。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為普通青霉（Penicillium commune）。

CF14菌株：在PDA培養基上，菌落局限生長，有大量放射狀皺紋；菌絲體白至微黃色，有大量黃色滲出液；菌落反面呈黃褐色，產生大量淡黃色可溶性色素。產生大量小分生孢子，分生孢子面藍綠色，呈橢圓形或近球形，鏈狀排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁光滑，帚狀枝三輪生，少量為兩輪生，稍叉開；結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為產黃青霉（Penicillium chrysogenum）。

CF9菌株：在PDA培養基上，菌落具有放射狀皺紋，質地絨狀，無滲出液。菌落反面灰綠色，無可溶性色素。產生大量小分生孢子，灰綠色，呈橢圓形，鏈狀排列，孢壁光滑；分生孢子梗壁平滑；帚狀枝通常三輪生，梗基緊貼。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為奧爾森青霉（Penicillium olsonii）。

TF18菌株：在PDA培養基上，菌落局限生長，具有放射狀皺紋；菌絲體白色，無滲出液；菌落反面呈淡黃色，無可溶性色素。產生大量小分生孢子，分生孢子面藍綠色，呈球形或近球形，鏈狀排列，孢壁上具有明顯的刺狀突起；分生孢子梗壁平滑，帚狀枝單輪生，偶有雙輪生。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為小刺青霉（Penicillium spinulosum）。

TF16菌株：在PDA培養基上，菌落有放射狀的溝紋；菌落中央呈土褐色，邊緣白色，無滲出液；菌落反面呈棕褐色。產生大量小分生孢子，呈球形或近球形，孢壁光滑；分生孢子囊直柱形，頂囊半球形；小梗雙層，排列緊密，布滿頂囊表面的2∕3。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為土曲霉（Aspergillus terreus）。

CF12菌株：在PDA培養基上，菌落生長迅速，有少量同心輪紋；菌落開始為白色，2～3 d后轉為灰綠色，無滲出液；菌落反面呈淺綠色。產生大量小分生孢子，呈球形，鏈狀排列，孢壁上有粗糙突起；分生孢子頭圓柱狀，頂囊綠色，燒瓶狀；小梗單層，布滿頂囊表面的3∕4。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

CF10菌株：在PDA培養基上，菌落生長迅速，初期為白色絨狀，后期轉為綠色至深綠色。產生小分生孢子，多為卵圓形，無色或綠色，簇生于小梗頂端，表面有刺突；分生孢子梗是菌絲的短側枝，側枝上對稱或互生分枝，形成二級和三級分枝，在分枝末端形成瓶狀小梗。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為深綠木霉（Trichoderma atroviride）。

CF19菌株：在PDA培養基上，菌絲初期呈白色，后期顏色加深，變為紅灰色，有同心輪紋。小分生孢子盤黑色、圓形或近圓形，較稀疏，分生孢子梭狀、單孢；剛毛密集，有分隔，基部膨大；分生孢子梗分枝。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為尖小叢殼菌（Glomerella acutata）。

TF5菌株：在PDA培養基上，菌落初期為白色，后期變為淡褐色，具有輪狀條紋；菌落背面呈土黃色。產生大分生孢子，呈紡錘形，直或略彎曲，由5個細胞構成，中間3個細胞褐色，并且3個細胞不同色，兩端細胞無色；頂部細胞圓錐形，有2根頂端附屬絲；具有分生孢子盤。結合形態學特征及系統發育分析，將其鑒定為擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）。見圖1。

2.2 草莓果防腐方法探索結果分別在室溫和4℃低溫貯存條件下，采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液對草莓果上的霉菌進行抑制，測定草莓果的保鮮效果。見表2。

表2 不同防腐處理后草莓的腐爛率（%）

圖1 草莓果霉菌的ITS序列系統發育樹

研究結果表明，4℃低溫貯存保鮮效果明顯優于常溫條件（P＜0.05）。通過比較不同防腐處理方法，可以看出，4℃低溫貯藏保鮮條件下，山梨酸溶液處理后草莓腐爛率顯著低于紫外照射和植酸溶液處理（P＜0.05）；且0.05%、0.10%和0.15%的山梨酸鉀溶液處理效果差異無統計學意義。故從成本及限量標準考慮，0.05%的山梨酸溶液處理是一種較為理想的草莓貯藏保鮮方法。

3 討論

草莓果極不耐貯運，常溫下存放1～2 d就會變色變味，開始腐爛變質〔8-9〕。因此，對草莓果上的微生物進行檢查與鑒定，并有針對性地研究適宜的草莓貯藏保鮮技術顯得尤為重要。草莓果上的微生物十分豐富，其微生物區系包括細菌、霉菌和酵母。潘見等〔4〕采用VITEK微生物自動鑒定系統對從草莓上分離到的細菌進行了鑒定，結果表明草莓細菌有8科10屬16種。目前對莓果上的霉菌研究較少，而實際上，霉菌引起草莓腐敗變質十分常見。李英華等〔10〕從新疆腐爛的草莓中分離到了4種真菌，分別是黑根霉、青霉屬、灰葡萄孢和疫霉屬。魏超等〔11〕從成都產的草莓中分離到4種真菌，鑒定為灰葡萄孢、青霉屬、單囊殼屬和曲霉屬。本研究從草莓果上分離鑒定了9種霉菌，包括青霉屬4種（普通青霉、產黃青霉、奧爾森青霉、小刺青霉）、曲霉屬2種（土曲霉和煙曲霉）、深綠木霉、尖小叢殼菌及擬盤多毛孢。由此可見，不同產地草莓果上的霉菌種類具有一定差異，這可能與氣候、環境、草莓品種等因素有關。但不同產地的草莓果上均分離到青霉，因此，青霉是引起草莓果腐敗變質的優勢霉菌。

草莓果的貯藏保鮮技術已成為當前研究的熱點，國內外研究和應用較廣泛的技術有低溫貯藏、氣調貯藏、防腐保鮮、涂膜保鮮等〔12-13〕。依據安全無毒、經濟可行、易于推廣的原則，本研究分別采用紫外殺菌、山梨酸溶液、植酸溶液處理結合低溫冷藏技術對草莓果的防腐效果進行探索。結果表明使用0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏抑菌效果最好。Allais等〔14〕的研究結果表明，近冰點溫度（例如2℃）貯藏采后的草莓，能顯著降低果實的生理代謝活動，從而極大地抑制微生物生長繁殖，延長草莓的保鮮期。

山梨酸是一種國際公認安全的防腐劑，聯合國糧農組織（FAO）、世界衛生組織（WHO）、美國食品藥品監督管理局（FDA）都對其安全性給予了肯定，其毒性僅為苯甲酸的1∕4、食鹽的1∕2，且對人體不會產生致癌和致畸作用〔15〕。山梨酸具有很好的抗菌性，能有效抑制霉菌、酵母菌及其他好氧菌，已廣泛應用于食品、飲料、醫藥、化妝品、農產品等行業。對于經表面處理的鮮水果、鮮蔬菜、醬漬的蔬菜、鹽漬的蔬菜、加工食用菌及藻類，中國制定的山梨酸的限量標準為0.5 g∕kg（即0.05%），而國際食品法典委員會（CAC）、FDA和日本則規定為1.0 g∕kg（即0.1%）。在本研究中，草莓果經0.05%山梨酸溶液浸泡后放置于4℃低溫冷藏，可保鮮6 d，具有較好的抑菌效果。本研究為草莓果的保鮮、貯藏及深加工過程中有目的地控制霉菌提供合理有效的依據。

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Isolation,Identification and Methods for Inhibiting Growth ofthe Spoilage Molds from Postharvest Strawberry Fruits

Yang Qianran,Gu Xiaoying,Zhang Yunjuan,Wang Wen,Li Lingfei*
（College ofFood Science and Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China）

Objective:The molds from spoilage strawberries were isolated and identified,and the methods for preventing rot were explored to provide a reasonable and effective basis for controlling the molds purposively during the processes ofkeeping fresh,storage and deep processing for strawberries.Methods:The molds isolated from strawberry fruits were identified by morphological characteristics and DNA sequence analysis.Results:The molds causing strawberry rot included Penicillium commune,Penicillium chrysogenum,Penicillium olsonii,Penicillium spinulosum,Aspergillus terreus,Aspergillus fumigates,Trichoderma atroviride,Glomerella acutata and Pestalotiopsis sp..Furthermore,the molds from strawberry fruits were inhibited respectively using ultraviolet,sorbic acid, phytic acid sterilization combining cold storage.It was showed that cold storage after 0.05%sorbic acid was the best preservative method for strawberry fruits.Conclusion:The molds causing strawberry rot were classified 5 genera and 9 species,among which Penicillium was the dominant genus causing strawberry rot.The present results showed that 0.05%sorbic acid solution was an ideal method forfresh keeping and storage ofstrawberries.

strawberry;molds;identification;inhibition

R154

A

2096-2266（2017）06-0059-05

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.06.014

（責任編輯李楊）

云南省中青年學術技術帶頭人后備人才資助項目（2011HB027）；云南省自然科學基金資助項目（2016FB030）

2017-01-04

2017-02-09

楊茜然，碩士研究生，主要從事食品微生物研究.

*通信作者：李凌飛，副教授，博士.