球形脂聯(lián)素對糖尿病心肌病大鼠心臟保護作用的研究

武鴻儒，李 興，高曉芳，韓雪鴻，劉 晶

球形脂聯(lián)素對糖尿病心肌病大鼠心臟保護作用的研究

武鴻儒，李 興，高曉芳，韓雪鴻，劉 晶

目的 觀察球形脂聯(lián)素(gAd)對糖尿病心肌病(DCM)的影響，并探討其可能作用機制。方法 30只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠選取10只作為正常對照組(A組)，余20只建造糖尿病心肌病模型，造模成功后大鼠隨機分為陽性對照組(B組)、球形脂聯(lián)素治療組(C組)。C組大鼠每日給予球形脂聯(lián)素治療。治療8周后，采用蘇木素伊紅(HE)染色法觀察大鼠心肌組織大體形態(tài)，免疫組化法檢測大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原蛋白、轉化生長因子-β1(TGF-β1)、Smad3、Smad7含量，原位末端標記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡。結果 HE染色示：B組大鼠心肌細胞排列紊亂；C組大鼠心肌細胞排列較B組整齊。免疫組化結果示：Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達較A組、C組增多(P<0.05)；Smad7蛋白表達較A組、C組減少(P<0.05)。TUNEL結果：B組凋亡細胞數(shù)較A組、C組增加(P<0.05)。結論 gAd可能通過降低心肌間質纖維化和減少心肌細胞凋亡兩方面保護心肌組織。

糖尿病心肌病；球形脂聯(lián)素；轉化生長因子-β1；纖維化；凋亡

糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病的主要心血管并發(fā)癥之一，可增加糖尿病病人的死亡率。脂聯(lián)素(APN)是體內(nèi)一種調節(jié)能量代謝的胰島素敏感性激素，已發(fā)現(xiàn)在糖尿病、心血管病病人體內(nèi)脂聯(lián)素含量減少，現(xiàn)已提出低循環(huán)水平脂聯(lián)素為心血管疾病的一個獨立預測因子[1]。近期研究發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素對心臟具有保護作用，本研究旨在觀察球形脂連素(gAd)對糖尿病心肌病心肌組織轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smads通路及細胞凋亡的影響，探討其對糖尿病大鼠心肌的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑 鏈脲佐菌素(STZ)購自美國sigma公司，gAd購自美國Peprotech公司，兔抗大鼠抗體購自武漢博士德生物工程有限公司，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。

1.2 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠30只，體重180 g～200 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。高糖高脂飼料由北京科澳協(xié)力有限公司提供，普通飼料由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.3 模型建立及分組 采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組(A組，n=10)與造模組(n=20)，分別給予普通飼料和高糖高脂料喂養(yǎng)。8周后，造模組給予空腹一次性腹腔內(nèi)推注1%STZ 30 mg/kg；A組經(jīng)腹腔內(nèi)推注等量檸檬酸-檸檬酸鈉鈉緩沖液。72 h后，尾靜脈測2次隨機血糖≥16.7 mmol/L，且出現(xiàn)多飲、多食、多尿、精神萎靡等現(xiàn)象為造模成功[2]，期間死亡3只。繼續(xù)喂養(yǎng)12周[3]后，造模組隨機分為陽性對照組(B組，n=8)、gAd治療組(C組，n=9)。C組給予10 μg/kg gAd每日腹腔注射，A組與B組每日腹腔注射同等劑量生理鹽水。8周后，取大鼠進行后續(xù)實驗。

1.4 實驗步驟 gAd干預8周后，空腹稱重，胸腹備皮后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，暴露腹腔，腹主動脈取血后一部分立即檢測糖化血紅蛋白(HbA1c)，一部分離心后取上清-70 ℃冰箱保存。剖開胸腔，取出心臟，沖洗后稱重，左心室同一部位取組織，放入保存液中，4 ℃過夜后制作石蠟切片。

1.5 生化指標檢測 全自動生化分析儀檢測空腹血糖(FBG)和HbA1c。

1.6 心肌組織形態(tài)觀察 蠟塊切片，行HE染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學變化。

1.7 免疫組織化學分析 心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組織化學分析：蠟塊切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，3%H2O2阻斷滅活內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復，滴羊血清封閉液孵育30 min甩干，后滴加1∶50稀釋的兔抗大鼠Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3、Smad7抗體4 ℃冰箱過夜，再滴加二抗孵育30 min，洗片后，加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液20 min，再洗片，加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染10 s，脫水、透明、封片。Scanscope數(shù)字病理掃描系統(tǒng)進行圖像分析，以出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性，測量灰度值。

1.8 TUNEL染色觀察凋亡 采用TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒對心肌組織切片進行熒光染色，在熒光顯微鏡下細胞核顯示紅色的細胞為凋亡細胞。TUNEL凋亡指數(shù)計算(AI)：AI=TUNEL標記陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。選擇細胞分布較均勻的高倍視野計數(shù)。

2 結 果

2.1 3組大鼠一般情況比較 8周后，與A組相比，B組大鼠FBG和HbA1c升高，體重下降，心重指數(shù)(HW/BW)明顯增加，gAd干預后C組較B組大鼠FBG降低、體重增加，HW/BW減小。詳見表1。

表1 3組大鼠一般情況比較(±s)

2.2 心肌組織形態(tài)學分析 光鏡下可見A組大鼠心肌細胞形態(tài)正常，胞核排列整齊；B組大鼠細胞大小不一，形態(tài)紊亂，核呈多形性，細胞間質增多，心肌細胞有斷裂現(xiàn)象；C組大鼠心肌細胞有病態(tài)改變，但較B組減輕。詳見圖1。

A組 B組 C組

圖1 心肌組織形態(tài)學分析(HE染色，×200)

2.3 3組大鼠心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組化分析比較 B組大鼠Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達較A組增多，Smad7蛋白表達較A組減少；gAd干預后C組Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3蛋白表達較B組減少，Smad7蛋白表達較B組增多。詳見表2、圖2～圖5。

表2 3組大鼠心肌組織Smad3、Smad7、TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白免疫組化分析比較(±s)

A組 B組 C組

A組 B組 C組

A組 B組 C組

A組 B組 C組

2.4 3組大鼠心肌細胞凋亡表達 B組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)較A組增加，C組大鼠心肌細胞凋亡數(shù)較B組減少，A組AI為16.49±0.83，B組AI為43.88±3.27，C組AI為23.43±1.77。A組與B組、C組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；B組與C組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見圖6。

A組：細胞凋亡較少

B組：大量細胞凋亡

C組：細胞凋亡數(shù)量較B組減少

3 討 論

DCM是指發(fā)生于糖尿病病人除冠心病、原發(fā)性心肌病、心臟瓣膜病及高血壓性心臟病外，以心肌細胞肥大、心肌微血管病變、心肌代謝紊亂、心肌間質增生及纖維化為主要病理變化，以早期心臟舒張、收縮功能障礙，晚期心力衰竭為其臨床癥狀的一種疾病[4]。糖尿病心肌病的發(fā)病機制尚不完全明確，有研究認為左室肥厚、心肌間質纖維化、心肌細胞糖脂代謝紊亂、小血管病變、心臟自主神經(jīng)調節(jié)異常、胰島素抵抗、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、線粒體損傷、氧化應激、細胞異常凋亡等是重要的促進因子，參與其發(fā)生和發(fā)展[5]。

TGF-β1是最有力和普遍存在的促纖維化細胞因子，Smad3和Smad7是其下游兩個重要介質[6]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，作為TGF-β1的下游信號分子，Smads蛋白在多種心臟病理生理狀態(tài)下均可出現(xiàn)活化和表達增加[7]。TGF-β1活化后，TGF-β1受體I(TβRI)磷酸化Smad2和Smad3，促進纖維化的發(fā)生和發(fā)展；而Smad7可結合TβRI并抑制Smad2/3磷酸化阻斷TGF-β1/Smad信號傳導阻止TGF-β1/Smad2/3信號[8]。Goyall等[9]發(fā)現(xiàn)慢性餐后高血糖癥，高胰島素血癥和胰島素抵抗等代謝異常可誘導TGF-β1的過表達，TGF-β1通過與Ⅱ型受體結合上調組織中膠原蛋白的表達，在心肌主要是Ⅰ型膠原蛋白，這個過程參與糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。有研究認為高血糖促進心肌中Ⅰ型和Ⅲ型膠原的形成，導致間質纖維化，進而導致左室舒張功能障礙[10]。心肌中Ⅰ型膠原以粗纖維形式存在，決定心肌的抗張力能力[11]。本實驗發(fā)現(xiàn)B組大鼠心肌中Ⅰ型膠原蛋白含量多于A組大鼠，也證實上述說法。本實驗B組大鼠心重指數(shù)增大，TGF-β1、Ⅰ型膠原蛋白、Smad3表達增加，Smad7表達減少，提示TGF-β1/Smads信號通路活化可促進糖尿病心肌病的發(fā)生發(fā)展。

脂聯(lián)素(adiponectin，APN)又稱Acrp30，是一種主要由脂肪細胞合成和分泌的脂肪細胞因子。有研究發(fā)現(xiàn)心肌細胞、肝細胞、肌肉細胞、骨骼肌成纖維細胞、成骨細胞等均可分泌脂聯(lián)素[12]。目前發(fā)現(xiàn)其具有改善胰島素抵抗、抗炎、抗纖維化、抗凋亡、抗動脈粥樣硬化等生物學效應[13]。在人類血漿中存在兩種APN活性形式分別為球形結構域(gAd)和全長型結構域(fAd)。gAd可由fAd經(jīng)彈性蛋白酶裂解而產(chǎn)生，gAd是APN實現(xiàn)生物學效應的主要區(qū)域[14-15]。本實驗中，外源性gAd干預后C組大鼠心重指數(shù)下降，Ⅰ型膠原蛋白、TGF-β1、Smad3表達較B組減少，Smad7表達增加，提示gAd可通過上調Smad7表達，減少Smad3表達來調節(jié)TGF-β1/Smads信號通路，減輕心肌纖維化來改善糖尿病心肌病。此結果與前期離體實驗結果一致[16]。

TUNEL細胞凋亡染色結果可見B組大鼠心肌細胞凋亡增加，外源性gAd干預后凋亡細胞減少，提示gAd可通過抗心肌細胞凋亡對糖尿病心肌病變起到保護作用。可能的作用機制為：①細胞色素C從線粒體釋放到細胞質激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-9，從而激活caspase-3效應物導致細胞凋亡，抗凋亡因子B淋巴細胞瘤(Bcl)-2可干擾細胞色素C釋放和抑制凋亡進展。作為對凋亡刺激的回應，促凋亡因子Bcl同源相關蛋白(Bax)通過過表達與構象變化對抗Bcl-2的激活，刺激細胞色素C釋放和其他凋亡蛋白進入細胞質，最終引發(fā)凋亡。gAd可誘導腺苷單磷酸活化蛋白激酶(AMPK)表達，激活其磷酸化，上調Bcl-2，下調Bax，進而起到抗凋亡作用[17]。②gAd可通過激活神經(jīng)酰胺酶，降低胞內(nèi)神經(jīng)酰胺含量，抑制蛋白激酶C(PKC)和蛋白磷酸酶2(PP2A)活化，從而激活蛋白激酶B(Akt/PKB)通路，進而減少心肌細胞凋亡；gAd還可能通過激活神經(jīng)酰胺酶促進抗凋亡代謝產(chǎn)物磷酸鞘氨醇(S1P)合成而抑制心肌細胞凋亡[18]。③gAd通過Akt依賴信號通路抑制非正常壓力反應引起的細胞凋亡，且gAd可通過抑制腫瘤壞死因子(TNF)α在心肌細胞中的表達減少凋亡[19]。

綜上所述，gAd可能通過抗心肌間質纖維化和抗心肌細胞凋亡兩方面減輕糖尿病心肌病變，對糖尿病心肌病具有一定的保護作用。

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(本文編輯薛妮)

The Cardioprotection of Globular Adiponectin on Diabetic Cardiomyopathy in Rats

Wu Hongru，Li Xing，Gao Xiaofang，Han Xuehong，Liu Jing

The Second Hospital，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，Shanxi，China

Liu Jing

Objective To observe the effect of globular adiponectin (gAd) on diabetic cardiomyopathy (DCM) and to explore its possible mechanism.Methods Thirty male Sprague-Dawley (SD) rats were divided into normal control group (group A)，and 20 rats were treated with diabetic cardiomyopathy model，the rats were randomly divided into positive control group (group B) and spherical adiponectin group (group C).Rats in group C were given globular adiponectin daily.After 8 weeks of treatment，the morphology of myocardium was observed by hematoxylin-eosin (HE) staining.The expression of type Ⅰ collagen，transforming growth factor-β1 (TGF-β1)，Smad 3 and Smad 7 in myocardium of rats were detected by immunohistochemistry.The apoptosis of myocardium was detected by TUNEL.Results HE staining showed that the arrangement of myocardial cells in group B was disturbed，and the arrangement of cardiomyocytes in group C was more neat than group B.The expressions of type Ⅰ collagen，TGF-β1 and Smad 3 protein in group B was higher than that in group A and group C (P<0.05).The expression of Smad 7 protein in group B was lower than that of group A and group C (P<0.05).TUNEL results showed that the number of apoptotic cells in group B was higher than that of group A and group C (P<0.05).Conclusion Globular adiponectin may protect cardiomyocytes by alleviating myocardial interstitial fibrosis and cardiomyocyte apoptosis.

diabetic cardiomyopathy；globular adiponectin；transforming growth factor-β1；fibrosis；apoptosis

山西省衛(wèi)生計生委科研項目(No.2014040)；山西省國際科技合作項目(No.2015081031)

山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院(太原 030001)

劉晶，E-mail：40574592@qq.com

信息：武鴻儒，李興，高曉芳，等.冬蟲夏草對腦缺血防治作用的研究進展[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2017，15(11)：1319-1327.

R587.1 R255.4

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.11.009

1672-1349(2017)11-1319-06

2016-12-25)