血清中乙型肝炎病毒轉錄的檢測在母嬰垂直傳播中的臨床意義

趙薇

[摘要] 目的 探究血清中乙型肝炎病毒轉錄的檢測在母嬰垂直傳播中的臨床意義。 方法 選擇解放軍第三〇二醫院2014年10月～2016年10月收治的HBV表面抗原（HBsAg）為陽性的40例產婦及其新生兒作為研究對象，按照HBeAg陰性/陽性分為HBeAg陽性組（21例）和HBeAg陰性組（19例），分別抽取2 mL母親外周血和新生兒臍靜脈血，提取RNA，經過逆轉錄及RT-PCR擴增，得到乙肝病毒DNA（HBx DNA），全長型病毒轉錄體（fRNA），頓挫型病毒轉錄體（trRNA），利用瓊脂糖凝膠電泳顯示出產物。 結果 HBeAg陽性組中母體HBx DNA陽性率和fRNA陽性率明顯高于HBeAg陰性組，差異有統計學意義（P < 0.05）。根據母體HBx DNA表型分為HBx DNA陽性組和HBx DNA陰性組。HBx DNA陽性組中母體fRNA陽性率、trRNA陽性率和新生兒trRNA陽性率高于HBx DNA陰性組，差異有統計學意義（P < 0.05）。 結論 與fRNA、HBx DNA相比，trRNA更早出現在HBV母嬰傳播過程中，有利于確定新生兒HBV感染情況，具有一定的輔助診斷價值。

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；垂直傳播；全長型病毒轉錄體；頓挫型病毒轉錄體

[中圖分類號] R512.6 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（c）-0117-04

[Abstract] Objective To explore the clinical significance of the test of serum hepatitis B virus transcription in maternal-infant vertical transmission. Methods From October 2014 to October 2016， 40 maternity patients with positive-HBV surface antigen （HBsAg） and their newborns in 302th Hospital of PLA were selected. All the patients divided into HBeAg positive group （21 cases） and HBeAg negative group （19 cases） according to the HBeAg negative/positive. 2 mL maternal peripheral blood and newborn navel blood were collected， the RNA was extracted， then the HBx DNA， fRNA， trRNA were got through reverse transcription and RT-PCR amplification， the products were showed by agarose gel electrophoresis. Results The positive rates of HBx DNA and fRNA of maternity patients in the HBeAg positive group were higher than those in the HBeAg negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Then the cases were divided into HBx DNA positive group and HBx DNA negative group according to the HBx DNA negative/positive. The positive rates of fRNA and trRNA of maternity patients and trRNA of newborns in the HBx DNA positive group were higher than those in the HBx DNA negative groups， with statistically significant difference （P < 0.05）. Conclusion TrRNA appeared in the process of mother-to-child transmission of HBV is earlier than fRNA， HBx DNA， which is helpful to determine neonatal HBV infection status， and has a certain auxiliary diagnostic value.

[Key words] Hepatitis B virus； Vertical transmission； fRNA； trRNA

乙型肝炎病毒（HBV）在發生慢性感染后可引起患者出現不同程度的肝實質損傷，且絕大多數成年人慢性感染者均為嬰幼兒時期感染所致。母嬰傳播是目前臨床上最為常見的最重要的嬰幼兒HBV感染途徑，母體感染HBV的性質、血清學狀態以及HBV病毒載量均于母嬰傳播的發生密切相關，合并HBV感染陽性的母體可通過宮內感染、產時傳播以及產后傳播等多種方式造成胎兒以及新生兒的HBV表面抗原（HBsAg）。目前臨床上主要以孕晚期感染HBV引起的新生兒感染作為常見，但HBV的母嬰傳播機制尚未研究清楚[1-2]。由于HBsAg和乙肝病毒DNA（HBx DNA）在新生兒感染早期的檢出率較低，且有研究顯示，HBV病毒的RNA檢出率要明顯高于相應的DNA檢出率，但僅有部分臨床樣本中能檢測到RNA，在一定程度上限制了RNA在疾病早期輔助診斷中的應用。為了進一步制訂有效方法從而阻斷HBV母嬰傳播的途徑，本研究針對乙肝病毒轉錄體中全長型病毒轉錄體（fRNA），頓挫型病毒轉錄體（trRNA）在母嬰傳播中的血清水平進行檢測展開研究，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇解放軍第三〇二醫院（以下簡稱“我院”）在2014年10月～2016年10月收治的40例HBsAg陽性的產婦及其新生兒作為研究對象，入院分娩的孕婦全部在初檢時接受了HBV病毒學檢測，HBeAg陰性/陽性分為HBeAg陽性組（21例）和HBeAg陰性組（19例）。新生兒中，男26例，女14例；HBeAg陽性組中，男11例，女10例；HbeAg陰性組中，男15例，女4例。本次試驗符合我院醫學倫理會的審核，全部患者均簽署了關于本次試驗的知情權同意書。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

①孕26周時采集孕婦空腹肘部靜脈血2 mL，待新生兒分娩后24 h后采集2 mL的股靜脈血，靜置0.5 h后采用給予低溫離心處理，4℃，4000 r/min，離心20 min，將血清分離，按照高純度病毒核酸提取試劑盒上的操作說明提取核酸。將其中poly（A）RNA替換成為tRNA，作為載體RNA[3]。②對目的核酸進行擴增，設置特異性引物，擴增病毒DNA采用50 μL反應體系，循環條件：93℃ 100 s，90℃ 40 s，58℃ 50 s，70℃ 40 s，35個循環，72℃ 15 min。trRNA、fRNA的RT-PCR系統在逆轉錄后采用半巢式PCR。PCR產物采用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后觀察結果。試驗所需儀器及試劑盒均由寶生物工程有限公司提供。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計軟件進行分析，計數資料采用χ2檢驗，以 P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBsAg陽性母體及新生兒血清HBx DNA及RNA檢測結果對比

HBeAg陽性組中，母體HBx DNA陽性率和fRNA陽性率均明顯高于HBeAg陰性組，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組母體及新生兒trRNA陽性率、新生兒HBx DNA陽性率、fRNA陽性率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表1。

2.2 不同HBx DNA表型母體與新生兒血清轉錄體檢測結果對比

根據母體HBx DNA表型分為HBx DNA陽性組和HBx DNA陰性組。HBx DNA陽性組中母體fRNA陽性率、trRNA陽性率和新生兒trRNA陽性率高于HBx DNA陰性組，差異有統計學意義（P < 0.05）。兩組新生兒fRNA陽性率和HBx DNA陽性率比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

乙型肝炎作為臨床上一類較為常見的疾病，具有較高的發病率，據大量資料顯示，HBN在母嬰傳播中具有較高的比例，所謂母嬰傳播是指HBsAg陽性的母親，尤其是伴有HBeAg陽性母親將HBV傳播給胎兒及嬰兒，多通過宮內傳播、產時傳播及產后傳播等途徑為主，對新生兒造成較大影響，合并HBV感染的孕婦早產率可明顯增加，其凝血功能也出現不同程度減退，嚴重時還可繼發胎盤絨毛間隙微血栓形成，使胎盤功能大大減退，明顯增加新生兒的窒息率、死胎率以及死亡率，但目前關于HBV母嬰傳播機制尚未明確[4-5]。隨著病毒學以及分子生物學研究的不斷深入以及相關科學技術的不斷發展，HBV母嬰垂直傳播的具體作用機制正在不斷明確中。早在20世紀80年代國外就有學者在HBsAg陽性孕婦的流產死胎肝細胞中檢測到病毒相關抗原的表達以及DNA，提示宮內感染與妊娠結局具有一定的相關關系。有報道指出，通過對新生兒HBV進行早期診斷及檢測仍可作為影響及治療HBV感染的關鍵與難題，分析其原因是HBsAg及HBx DNA在新生兒感染中具有較低的早期檢出率，未能達到令臨床工作者滿意的目的[6-7]。另有研究資料顯示，病毒RNA的檢出率相比于對應的DNA檢出率較高，主要是指部分樣本中僅可診斷出病毒RNA，這表明當機體發生HBV感染后，病毒RNA的檢測更加的準確，同時具有更高的靈敏度，可全面地反映出HBV感染狀態[8-10]。結合本次試驗結果發現，在發生HBV感染后的新生兒血液循環中可出現大量的HBV轉錄體，作為病毒感染早期的病毒代謝產物，將其作為診斷HBV的早期指標具有重要的意義[11-13]。

有專家學者指出，fRNA與HBx DNA具有密切的相關性，并呈現出正相關關系，可將其作為病毒復制的一個重要指標，其中trRNA可用于標記病毒的持續感染狀態，這與本次研究結果基本一致[14-15]。另外，新生兒血清中病毒轉錄體中幾乎均以trRNA存在，這與母體血清中病毒轉錄體的情況完全不同，說明fRNA的轉錄以及HBxDNA的復制仍處于未被激活的狀態，或正處于某種抑制狀態下，隨著疾病的進展及感染時間的延長，這些陽性病例即可慢慢進展為顯性感染，而另一類的病例則不會出現顯性感染，但卻可以長時間攜帶trRNA，并逐年進展成為隱匿性的HBV感染，此時仍需要大量時間進行觀察，并引足夠的重視[16-18]。對于隱匿性HBV感染患者，患兒體內病毒可能已經全部或大部分被清除，或者僅攜帶微量的有復制功能缺陷的HBV病毒，從而成為隱匿性感染患者。研究指出，隱匿性感染的發生可能與HBV基因的DNA序列變異以及HBV DNA在宿主細胞染色體中整合作用有關，同時與HBV的外周血單核細胞感染以及相關HBV免疫復合物的形成也具有一定的相關關系。隱匿性感染者的存在具有重要的臨床意義，其在免疫抑制的狀態下可重新進去疾病的活動期，進展為典型的乙型肝炎，現已成為熱議的公眾健康問題。

另外，研究中發現，母體自身的免疫功能狀態及其血液循環中的HBV病毒載量與HBV的母嬰垂直傳播的而發生具有影響的相關關系，合并HBV陽性的孕婦，其臍帶血的HBx DNA陽性率明顯偏高。本研究結果顯示，母體為trRNA陽性的新生兒中trRNA的檢出率要明顯高于母體為trRNA陰性的新生兒，說明母體與新生兒血中trRNA的檢出關系更加密切，也一定程度表明受感染的新生兒血中出現的標志物可出現在不同時相中，但仍值得進一步研究與證實[19]。另外，當新生兒血清中存在HBsAg時通常被認為處于一種具有保護作用的狀態下，而非完全的非感染狀態，結合本次研究結果，可見HBsAg陽性的新生兒中HBxDNA及fRNA檢出率要明顯低于trRNA[20]。為此，可認為trRNA相比于fRNA、HBxDNA相比，更早出現在HBV母嬰傳播過程中，有利于確定新生兒HBV感染情況，具有一定的輔助診斷價值。

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（收稿日期：2017-02-16 本文編輯：李岳澤）