血漿miR-1、miR-133a以及miR-126—急性心肌梗死的新型生物學標記物

李翠如，趙春霞

(1.洛陽市第一人民醫院，河南 洛陽 471002；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

·臨床醫學·

血漿miR-1、miR-133a以及miR-126—急性心肌梗死的新型生物學標記物

李翠如1，趙春霞2

(1.洛陽市第一人民醫院，河南 洛陽 471002；2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院，湖北 武漢 430030)

目的：探討急性心肌梗死(AMI)早期血漿miR-1、miR-133a以及miR-126的水平變化，與血漿cTnI的相關性，及三者是否可作為早期診斷AMI標記物。方法：應用real-time PCR方法，檢測24位AMI患者以及8名對照者血漿miR-1、miR-133a以及miR-126的含量，運用ELISA方法檢測血漿肌鈣蛋白I(cTnI)濃度。ROC曲線分析上述三種血漿miRNAs在AMI中的診斷價值及意義，并分別與cTnI相對比。結果：三種循環miRNAs在AMI患者中均存在顯著差異性表達，其中AMI患者血漿miR-1的含量較對照組增高約46.6±11.9倍(P=0.001)，血漿miR-133a的濃度較對照組增高39.9±9.5倍(P<0.05)。AMI患者血漿miR-126的水平較對照組顯著降低,約為對照組的0.11±0.01倍(P<0.05)。關聯性分析表明血漿miR-1以及miR-133a的含量與cTnI呈顯著正相關；ROC曲線分析發現，三者均有顯著的診斷價值，其中以低表達的miR-126診斷效力最強(AUC：1.000，95%可信區間為0.000～1.000)。聯合miR-1和miR-133a顯著提高二者的診斷效能(AUC：0.964，95%可信區間為0.000～1.000)。結論：AMI早期血漿miR-1、miR-133a以及miR-126水平變化顯著，與血漿cTnI相關性好，可作為早期診斷AMI標記物，具有臨床應用前景。

急性心肌梗死；miRNAs；生物學標記物

急性心肌梗死(AMI)，具有較高的患病率及致死率，是嚴重危害人類健康的心血管急危重癥之一。早期正確地識別和診斷AMI對于提高患者生存率，改善患者預后極為重要。肌鈣蛋白因具有較好的特異性和靈敏度，一直以來都被用作診斷AMI最為重要的生物學標記物，但是在一些非AMI的情況下，如慢性腎病、感染性休克、膿毒血癥等，其含量亦會升高，這無疑對早期診斷AMI造成困擾。因此需要尋求一些新的有效的生物學標記物，以便更加準確地對AMI做出判斷。

MicroRNAs(miRNAs)是一種內生性、小分子、非編碼RNAs，成熟的miRNAs僅由21-25個堿基組成，不具備蛋白翻譯功能，其主要的生物學作用是在細胞漿內通過與靶信使RNAs的3′端非編碼區(3′UTR)序列完全或不完全互補結合，促進靶信使RNAs的降解或抑制其蛋白的翻譯，從而在轉錄后水平調控基因的表達。研究發現機體內約1/3的編碼基因接受miRNAs的調控。隨著研究的深入，越來越多的miRNAs被證實在多種生理和病理過程中扮演著極為重要的角色。2008年研究者們在血漿中發現了循環miRNAs(或血漿miRNAs)的存在，隨后研究表明，循環miRNAs具有極強的穩定性，其通過與囊泡、HDL以及RNA相關結合蛋白結合，能有效地逃避血漿中高活性的RNase酶的降解[1]。因而穩定存在于血漿中的循環miRNAs被廣泛證實可以作為診斷和鑒別疾病的重要生物學標記物[2]。近年來，血漿miRNAs亦逐步被發現可成為診斷各類心血管疾病重要的生物學標記物。如血漿miR-423-5p可能是診斷心力衰竭極強的預測因子；循環miR-208和miR-499則可作為心肌損傷疾病(病毒性心肌炎)的生物標記物。miR-1以及miR-133a是心肌來源的miRNAs，而miR-126則來源于內皮細胞，前期研究表明上述三種miRNAs與心肌損傷密切相關，那么它們是否可以成為診斷AMI的生物標記物？其診斷價值如何？目前仍不清楚。為探討該問題，本研究檢測了AMI患者血漿miR-1，miR-133a以及miR-126的含量，并將其與對照人群相比較，從而探討血漿miR-1、 miR-133以及miR-126作為診斷AMI生物學標記物的可能性，明確上述循環miRNAs對AMI的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究人群

24位急性心肌梗死患者及8位非冠心病(冠脈造影證實)的胸痛患者被納入本研究。全部急性心肌梗死患者均是于2015年在華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院心內科救治，在征得患者及家屬知情同意后留取5ml新鮮血液標本于EDTA抗凝管中，經低溫離心后，留取上層血漿置于-80℃冰箱保存備用。

1.2 血漿RNAs提取、逆轉錄及Real-time PCR檢測

運用TRIzol LS Reagent(Invitrogen)提取血漿總RNAs，每250 mL新鮮血漿加入750 mL TRIzol LS，充分震蕩混勻后，采用酚-氯仿抽提法抽提血漿RNAs。運用逆轉錄試劑盒(Transcript First-strand cDNA synthesis SuperMix北京全式金生物技術有限公司)逆轉錄血漿miR-1以及miR-133a；逆轉錄引物(The Bulge-LoopTMmiRNA RT primer)購于廣州銳博生物科技有限公司。SYBR Green PCR SuperMix試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)用于檢測血漿miR-1以及miR-133a的含量，以血漿U6作為內對照。

1.3 血漿肌鈣蛋白I(cTnI)檢測

運用Human Troponin I ELISA試劑盒(臺灣亞諾法生技股份有限公司)檢測AMI患者及對照人群血漿cTnI含量，具體步驟見試劑盒使用說明書。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 血漿miR-133a、miR-1及miR-126的水平

表1為所有研究者的基本臨床資料。兩組人群在性別，年齡，吸煙，飲酒，以及罹患高血壓、糖尿病上均無統計學差異(P>0.05)，具有較強的可比性。圖1結果提示血漿miR-1(A)及miR-133a(B)的含量在AMI患者明顯升高，分別較對照組升高約47倍和40倍。而令人感興趣的是，血漿miR-126(C)的水平在心梗患者較正常對照組顯著降低(下降約10倍)。與此同時，還檢測了傳統AMI標記物：cTnI的血漿含量，AMI患者 為(7.47±2.59 ng/mL)較對照組(0.015±0.003 ng/mL)顯著升高(P<0.01)(圖2)。

表1 AMI患者及對照者基本臨床資料

圖1 AMI患者血漿miR-1(A)、miR-133a(B)及miR-126(C)的表達水平； **P<0.01

Fig1 The Expressions of Plasma miR-1, miR-133a, and miR-126 of AMI PatientsP<0.01

圖2 AMI患者血漿肌鈣蛋白I(cTnI)的含量；**P<0.01

2.2 血漿miR-1及miR-133a與cTnI的相關性

本研究分別將上述三種miRNAs與cTnI進行了關聯性分析，結果如圖3所示：血漿miR-1(A)以及miR-133a(B)與cTnI存在顯著正相關，其相關性系數r分別為0.397和0.394，而血漿miR-126含量與cTnI無明顯相關性；這一結果可能提示：血漿miR-1、miR-133a與cTnI可能均由受損壞死心肌細胞釋放而來，而內皮源性的miR-126則不受壞死心肌細胞的影響。

圖3 急性心肌梗死患者血漿miR-1(A)、miR-133a(B)與cTnI的相關性；

Fig3 The Correlation of Plasma Levels of miR-1(A) and miR-133a (B) of AMI Patients with Plasma cTnI

2.3 血漿miR-1，miR-133a以及miR-126對于AMI的診斷價值

通過ROC曲線分析，可明確血漿中差異性表達的miR-1，miR-133a以及miR-126對診斷AMI的意義。在AMI患者中，血漿miR-1，miR-133a以及miR-126均表現出極強的診斷價值，它們的ROC曲線下面積(AUC)分別是0.938(95%可信區間為0.000～1.000)、0.875(95%可信區間為0.755～0.995)以及1.000(95%可信區間為0.000～1.000)(圖4)。這一結果表明血漿miR-1，miR-133a以及miR-126均具有較強的診斷AMI的能力，其中以血漿miR-126的診斷效能最強，其診斷能力與傳統AMI標記物cTnI近似。此外，還發現盡管升高的血漿miR-133a和miR-1 與cTnI(AUC:1.000，95%可信區間0.000～1.000)相比沒有表現出更強的診斷價值，但將miR-1和miR-133a視作整體進行評估，能夠極大的提高其診斷價值(表2)， ROC曲線下面積為0.964(95%可信區間為0.000～1.000)。

圖4 血漿miR-1、miR-133a以及miR-126在心肌梗死中的診斷價值；ROC Curve (receiver operator characteristic curve)：ROC 曲線

表2 血漿miR-1，miR-133a以及miR-126診斷心肌梗塞的ROC曲線下面積

AUC：ROC曲線下面積；cTnI：心肌肌鈣蛋白I; MiR-1+MiR-133a：miR-1聯合miR-133a;

3 討論

miRNAs的組織特異性、血漿穩定性以及其在疾病狀態下的差異性促成了其成為疾病新的生物學標記物的可能。大量的研究表明循環miRNAs可成為多種疾病的生物標記物[3]。隨后在心血管領域，越來越多的血漿miRNAs被證實可以成為包括心力衰竭、冠心病、高血壓在內的多種心血管疾病的潛在生物學標記物。其中，最受關注的仍然是AMI。AMI是以突發的心肌細胞壞死為特征，常伴隨著一些心肌細胞內容物的釋放，這其中包括心肌特異性的miRNAs。在AMI時，心肌來源的miR-208及miR-499將大量釋放入血，從而使其血漿含量顯著升高，具有較強的診斷價值。除此之外，一些非心肌特異性的miRNAs，如miR-21、miR-361-5p、miR-30、miR-195、let-7b等在AMI患者血漿中也存在顯著的差異性表達[4]，因此非心肌源性的血漿miRNAs也可能具有診斷AMI的能力。

miR-133a和miR-1均是心肌細胞含量豐富的miRNAs。前期的研究發現，血漿miR-133a與AMI密切相關；在早期的研究中，研究人員對比了急性冠脈綜合征(ACS)患者體循環與冠脈循環中miRNAs的表達譜，研究發現ACS患者冠脈循環中miR-133a的含量較體循環明顯增高，這一有趣的結果可能提示：在心肌損傷時，受損細胞內的miR-133a將從損傷心肌大量釋放入冠脈循環中，并最終入血液循環。另一項研究發現，鈣離子可刺激細胞分泌外泌體，從而釋放miR-133a。此外，有研究還發現血漿miR-133a含量與冠心病患者冠脈狹窄程度呈正相關，在一定程度上，miR-133a對于診斷隱匿性的冠心病優于cTnI[5]。動物實驗研究提示血漿miR-1與AMI相關，研究表明血漿miR-1水平在AMI時顯著升高，6小時即達到高峰，其濃度與模型動物心梗面積呈正相關。MiR-126是內皮來源的miRNAs，早期研究表明，血漿miR-126水平在冠心病患者中顯著降低。同時其含量在心衰患者中也存在差異性表達，其水平與心衰患者的年齡以及NYHA分級呈負相關。

本研究選擇了miR-1，miR-133a以及miR-126作為主要的研究對象，同時以非心源性胸痛的患者作為對照，探討3種循環miRNAs在AMI時的含量變化，及其對AMI的診斷價值。結果提示血漿miR-1及miR-133a的水平在AMI患者顯著增高，而血漿miR-126的含量則顯著降低。此外，本研究發現AMI患者增高的血漿miR-1以及miR-133a含量與cTnI濃度呈正相關。ROC曲線分析發現三者均有極強的診斷價值。其中以血漿miR-126的診斷效能最強，與傳統心梗標記物cTnI相近似。更有趣的是，將miR-1和miR-133a作為整體評估，能更進一步提升其診斷AMI的能力。因此，三者均可能成為診斷AMI新的潛在生物學標記物。

近年來，隨著研究的深入，研究者們對循環miRNAs有更多的期待。循環miRNAs不僅能提高疾病診斷的準確度和精度，還被發現可用于評估疾病發生不良事件的風險及預后[6]。同時，循環miRNAs被證實是具有生物學功能的小分子，它們在細胞-細胞間的信息交流傳遞中也發揮著重要作用[7]。因此，更多的更深入的研究有待進一步的展開。

[1] Wang F, Chen C, Wang D. Circulating MicroRNAs in Cardiovascular Diseases: from biomarkers to therapeutic targets[J]. Front Med,2014(8): 404-418.

[2] Alipoor SD, Adcock IM, Garssen J, et al. The Roles of MiRNAs as Potential Biomarkers in Lung Diseases[J]. Eur J Pharmacol,2016,791: 395-404.

[3] Guo Z, Zhao C, Wang Z. MicroRNAs as Ideal Biomarkers for the Diagnosis of Lung Cancer[J]. Tumour Biol,2014,35: 10395-10407.

[4] Wang F, Long G, Zhao C, et al. Atherosclerosis-Related Circulating miRNAs as Novel and Sensitive Predictors for Acute Myocardial Infarction[J]. PLoS One,2014(9): 105734.

[5] Wang F, Long G, Zhao C, et al. Plasma microRNA-133a is a New Marker for Both Acute Myocardial Infarction and Underlying Coronary Artery Stenosis[J]. J Transl Med,2013(11): 222.

[6] Zampetaki A, Willeit P, Tilling L, et al. Prospective Study on Circulating MicroRNAs and Risk of Myocardial inFarction[J]. J Am Coll Cardiol,2012,60: 290-299.

[7] Hergenreider E, Heydt S, Treguer K, et al. Atheroprotective Communication between Endothelial Cells and Smooth Muscle Cells through MiRNAs[J]. Nat Cell Biol,2012,14: 249-256.

本文編輯：王知平

Plasma miR-1, miR-133a, and miR-126 as Novel Biomarkers of Acute Myocardial Infarction

LI Cuiru1，ZHAO Chunxia2

(1.TheFirstPeople'sHospitalofLuoyangCity，Luoyang471002，Henan,China；2.TongjiHospitalAffiliatedTongjiMedicalCollegeofHuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,Hubei,China)

Objective: To study the changes of miR-1, miR-133a, and miR-126 in the early acute myocardial infarction patients, the correlation of the three of them with plasma cardiac troponin I (cTnI), and powerful biomarkers for the early diagnosis of acute myocardial infarction.Methods:Total 24 patients with acute myocardial infarction (AMI) were recruited in this study. The expressions of circulating miR-1, miR-133a, and miR-126 were detected in 24 AMI patients and 8 healthy people as control group by real-time PCR. Plasma cardiac troponin I (cTnI) concentrations were measured by ELISA. The receiver operating characteristic (ROC) curve was used to assess the diagnostic value of these three circulating miRNAs for diagnosing AMI.Results:According to the study, there was significantly differential expression observed in these three miRNAs，in which the expressions of miR-1 (46.6±11.9 fold)(P=0.001) and miR-133a (39.9±9.5 fold)(P<0.05) were remarkably increased in AMI patients, whereas the concentration of miR-126 (0.11±0.01 fold)(P<0.05) was reduced. The correlation analysis showed that plasma levels of miR-1 and miR-133a were positively correlated with plasma cTnI. ROC analysis revealed that all of these three circulating miRNAs had significant diagnostic value. Among Which, the diagnostic power of miR-126 was the strongest (AUC: 1.000, 95% confidence interval 0.000-1.000). The combination of miR-1 and miR-133a significantly improved the diagnostic accuracy (AUC: 0.964, 95% confidence interval 0.000-1.000).Conclusions:Circulating miR-1, miR-133a, and miR-126, the correlation of which with plasma cardiac troponin I (cTnI)has been proved, can be potential and powerful biomarkers for early diagnosis of acute myocardial infarction.

acute myocardial infarction; miRNAs; biomarker.

國家高技術研究發展計劃(2014AA022304)

李翠如，女，主管檢驗師，從事檢驗臨床工作

R446.11

A

1671-0126(2017)03-0004-05