小兒腦性癱瘓與GAD1基因相關性研究分析

魏慧珍，尚 清

(鄭州兒童醫院，河南 鄭州 450000)

小兒腦性癱瘓與GAD1基因相關性研究分析

魏慧珍，尚 清*

(鄭州兒童醫院，河南 鄭州 450000)

目的：分析研究小兒GAD1基因中第2、7、10號外顯子突變與小兒腦性癱瘓之間的相關性。方法：對94例腦性癱瘓患兒(研究組)以及同期收治的非神經系統疾病和非腦癱患兒94例(對照組)進行分子生物學研究，經患兒家長同意后收集所有兒童的外周血，利用試劑盒提取其DNA，并設計引物，采用PCR-SSCP對腦性癱瘓患兒和對照組兒童GAD1基因部分外顯子檢測。結果：研究組和對照組中所有兒童進行PCR-SSCP檢查之后發現，所有兒童GAD1基因中第2、7、10號外顯子均未有異常突變，兩組相比差異無統計學意義(P>0.05)。結論：GAD1基因中第2、7、10號外顯子在小兒腦性癱瘓患者中均不存在突變現象，說明小兒腦性癱瘓與其GAD1中第2、7、10號外顯子之間可能無相關性，但是并不排除與其他外顯子之間存在相關性。

小兒腦性癱瘓；GAD1基因；外顯子

小兒腦癱主要是由于患兒在出生前或者出生后1個月內受到各種綜合因素的影響，進而影響患兒大腦發育或者出現腦損傷等情況，出現一系列的運動性障礙綜合征[1]。腦性癱瘓患兒的臨床特點為姿勢異常、中樞性運動障礙，同時伴隨有智力、認知能力、聽力、語言功能、感覺功能障礙等情況[2]。該病在臨床上具有較高的病死率，隨著近年來醫學技術水平的發展，腦性癱瘓患兒臨床死亡率有所下降，但是腦癱患兒中高危患兒的存活率提高，進而使得該病在臨床上的發病率逐年增長[3]。因此，研究腦性癱瘓的病因是目前臨床研究的重點話題。大量文獻研究表明，腦性癱瘓患兒的發病與遺傳易感性之間關系密切，存在家族遺傳史的腦性癱瘓患兒的發病率較高[4]。本文對94例腦性癱瘓患兒以及同期收治的非神經系統疾病和非腦癱患兒94例進行分子生物學研究，探討腦性癱瘓患兒的發病與其GAD1基因之間的相關性，現對具體內容分析報告如下。

1 資料及方法

1.1 一般資料

本文研究對象是鄭州兒童醫院2015年11月～2016年11月收治的94例腦性癱瘓患兒以及同期收治的非神經系統疾病和非腦癱患兒94例。其中94例腦性癱瘓患兒為研究組，94例非腦癱患兒為對照組。研究組中患兒男女比例49：45；患兒年齡1個月～3歲，平均(1.82±0.78)歲；其中79例患兒為痙攣型，15例患兒為不隨意運動型。對照組中男女患兒比例為46：48；患兒年齡2個月～4歲，平均(1.93±0.89)歲。兩組患兒男女構成比例以及年齡相比無差異(P>0.05)。所有患兒家屬均自愿簽署知情同意書。

1.2 試劑和儀器

DNA提取試劑盒(廣州東生生物有限公司生產)；Taq DNA聚合酶(大連寶生物有限公司)；所用其他試劑純度為分析純。Thermo fisher Scientifile-905低溫冰箱(美國Thermo公司)； JY 600C 型電泳儀、JY-SPCT 型水平電泳槽和JY-SQ6 型垂直電泳槽(北京君意東方公司生產)； GIS型凝膠圖像處理系統(上海天能公司生產)； 7300 型熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司)。

1.3 方法

采集兩組患兒靜脈血2mL，置于經過EDTA抗凝處理的試管中，標記并保存于-80℃，采用DNA提取試劑盒對所有患兒血液中基因組DNA進行提取，之后進行定量分析和純度分析。分析之后進行PCR擴增GAD1基因中第2、7、10號外顯子，外顯子引物序列交由北京英俊公司合成，具體見表1。

表1 GAD1基因進行PCR擴增中引物序列、擴增片段長度和退火溫度

PCR擴增過程中體系為50 uL，0.25 uLTaq酶，5 uL10×Buffer，4 μL dNTP，1 μL DNA，正向引物、反向引物各1 μL，37.75 μL雙蒸水，利用渦旋儀充分混勻后放入PCR 儀中。PCR 反應條件：預變性溫度94℃，時間5 min；變性溫度94℃，時間30 s，退火溫度55℃、56℃，時間30 s，延伸溫度72℃，時間60 s，共進行35 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物電泳時間約30 min，利用凝膠成像系統對結果進行觀察。SSCP：制備6%聚丙烯酰胺凝膠60 mL，用于配膠。迅速將PCR產物在98℃變性10 min后轉移至冰浴中進行上樣，電泳條件：溫度為4℃，300 V電泳5 min，120 V電泳13 h。最后進行固定、染色與顯色，利用凝膠成像系統對結果進行觀察。經上述分析后對懷疑有外顯子突變的樣本PCR產物進行送樣純化分析。

1.4 統計學方法

2 結果

研究組和對照組共188例患兒血樣進行PCR-SSCP篩查, 結果發現，研究組中有1例患兒血液樣本中GAD1中第2外顯子在SSPC電泳結果中出現異常條帶(見圖1中箭頭所示)，其他外顯子和對照組中所有外顯子均未有異常條帶出現。對出現異常的條帶進行送樣純化分析，結果顯示未有突變情況。

圖1 研究組GAD1第2外顯子SSCP圖

圖2 對照組GAD1第2外顯子SSPC圖

3 討論

GAD(谷氨酸脫羧酶)的作用主要是通過將氨基酸與興奮性的神經遞質谷氨酸鹽形成抑制性的神經遞質γ氨基丁酸的主要限速酶[5]。GAD的主要結構為磷酸吡哆醛(PLP)和脫輔基酶蛋白，其中PLP為輔基，是GAD發揮活性的關鍵。GAD酶活性的調節主要是通過GAD控制體內PLP以及脫輔基酶蛋白通過聚合和解離進行調節[6]。GAD水平高低和活性在一定程度上決定了機體內谷氨酸和γ氨基丁酸的濃度。近年來，大量的研究表明GAD與多種神經系統疾病的發生有關，常見的疾病包括精神分裂癥、癲癇等。另外有文獻表明GAD與糖尿病的發生也有密切關系[7]。

本次研究對GAD1基因外顯子進行研究分析，通過PCR擴增技術對GAD1基因第2、7、10外顯子進行擴增，并進行SSCP分析，結果表明，研究組中有1例患兒第2外顯子發生異常，但是經過提純分析發現未有突變情況，而對照組檢測結果顯示未有任何突變發生。 這一結果與Lynex等的研究結果存在差異，文獻中報道，腦癱患兒的GAD1基因有突變情況，而本次研究中并未有突變。這一結果的原因可能患者的種族差異相關。同時也有可能受到樣本數量的影響，具體情況有待于進一步研究。

綜上所述，小兒腦性癱瘓與GAD1基因中第2、7、10號外顯子突變無相關性，但是這一結果并不表示小兒腦性癱瘓與其他外顯子突變無相關性，本文的研究只是初步驗證，有關小兒腦性癱瘓與基因以及突變位點的研究有待于進一步深入。

[1] 張 麗. 引導式教育在小兒腦癱康復中的作用[J]. 中國康復理論與實踐，2012, 18(4): 362-364.

[2] 湯明麗，呂復莉，唐久來. 小兒神經康復中心小兒腦癱康復治療的現狀及進展[J]. 安徽醫學，2012, 33(9): 1255-1257.

[3] 陳國新，蘇 衡. 小兒腦癱患者合并肺部感染的臨床特點[J]. 廣東醫學，2012, 33(16): 2440-2441.

[4] 張曉杰，郭繼東，伊洪波. 小兒腦癱患者的危險因素分析[J]. 中國婦幼保健，2012, 27(29): 4549-4551.

[5] 高志平，賈 寧. 小兒腦癱病因學研究進展[J]. 中國婦幼保健，2012, 27(1): 149-150.

[6] 李紅麗. 小兒腦癱45例的家庭綜合康復訓練效果分析[J]. 中國兒童保健雜志，2012, 20(6): 555-558.

[7] 鄒小英，石 堅，方素珍，等. 多種定位方式下A型肉毒毒素肌肉注射治療小兒腦癱肌痙攣的療效[J]. 廣東醫學，2013, 34(6): 882-884.

本文編輯：王 霞

鄭州市科學技術局科研項目(20140508)

魏慧珍，女，醫師，從事神經電生理及癲癇，神經免疫性疾病臨床工作

尚 清，女，主任醫師，教授，E-mail:578623597@qq.com

R725

A

1671-0126(2017)03-0015-03