應用Taq Man熒光定量PCR技術建立HIV前病毒檢測方法

溫 瑞， 李黎明，孫 潔，孔維賓

(開封市疾病預防控制中心，河南 開封 475000)

應用Taq Man熒光定量PCR技術建立HIV前病毒檢測方法

溫 瑞， 李黎明，孫 潔，孔維賓

(開封市疾病預防控制中心，河南 開封 475000)

目的：使用熒光定量方法PCR對HIV前病毒進行檢測，并建立相應預防機制。方法：對8E5細胞實施培育，然后收集并計數，將其核酸進行提取，并通過熒光定量來對HIV前病毒的逆轉錄基因片段實施擴增。 結果：通過實時PCR技術對HIV前病毒實施熒光定量檢測，可達1拷貝的靈敏度，并取得較為穩定的擴增效果。 結論：利用PCR技術能夠做到系統檢測HIV前病毒，有利于日后對潛伏感染細胞的鑒定篩選以及對抗HIV治療的及時反饋。

HIV前病毒；PCR技術；熒光定量

HIV作為最受關注的雙鏈RNA逆轉錄病毒，主要感染具有CD4+表面標志的細胞，其中CD4+T細胞群是HIV攻擊的主要靶細胞。CD4+T細胞活化后內部的HIV病毒的核酸嵌合細胞染色體，并逆轉錄RNA、剪切基因片段和翻譯，在完成這一系列過程后會釋放相當數量的病毒顆粒在細胞組織間，而本身的宿主細胞往往會因此死亡。但一部分的CD4+T細胞感染HIV病毒程度較輕，所產生的病毒顆粒數量極少甚至不產生，T細胞核內卻嵌合(非嵌合形式也占相當數量)HIV前病毒的基因物質，從而導致潛伏性感染情況的發生[1]。HIV病毒以上述細胞為其屏障和滋生的病毒庫，形成繁殖循環在適宜環境下再次復制相當數量的病毒，以實現自身在血漿中的快速增值。

當前技術條件下抑制HIV感染者血漿病毒滴度的臨床手段主要為醫學界通用的高活性抗逆轉錄病毒技術，即HAART，可以達到一定的療效，然而在徹底清除患者淋巴組織和外周血的HIV前病毒上尚不能達到理想效果。HIV前病毒經過靶向HIV潛伏感染細胞治療手段可以受到一定程度的抑制，所以通過熒光定量PCR技術檢測HIV前病毒可以幫助優質抗HIV藥物的鑒定篩選，對潛伏感染細胞的治療有著良好的積極意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

8E5細胞中平均拷貝有1個HIV前病毒，本次試驗由Invit．ogen公司提供培養基，使用GIB-O公司生產的鏈霉素、青霉素和胎牛血清，invitrogen公司提供熒光染料ROX，Promega公司的p GEM—T為載體產品，用生化試劑按通例使用；熒光定量PCR儀選用PE公司的ABl 7000，Aoker公司合成探針及引物。

1.2 檢測方法

1.2.1 細胞培養 通過常規培養液RPMl 1640培養8E5細胞，其中加入1%青+鏈霉素和20%胎牛血清，在恒溫恒濕的培養箱中放置細胞置。

1.2.2 提取HIV前病毒核酸 計算8E5細胞數量，離心操作，撇去上清液，隨后加入懸浮細胞PBS，離心速度控制為800 r/min，重懸蛋白酶K，孵育樣品在55℃下加入TNES飽和苯酚，充分晃動，收集上清并加入同量的氯仿/苯酚/異戊醇，再次室溫下充分晃動，取上清，加大量乙醇，洗2次以上；保持干燥室溫，溶解于ITE。

1.2.3 HIV前病毒擴增的Taq Man熒光定量標記 收集細胞(約106個)，提取HIV前病毒，依次10倍比例稀釋，制成106～10。拷貝樣品。熒光定量實時PCR檢測為：5 u/t-lDNA聚合酶0．4 pl，擴增模板20 pl，25 pmol/L探針0．1 pl，5 t Llmol/L上下游引物，總體積30 pl。

1.2.4 鑒定HIV前病毒的擴增片段 將擴增結果再次經驗，用2%瓊脂糖凝膠對PCR反應產物進行電泳，拍照并在紫外燈下觀察。p GEM—T載體在回收后應對其擴增片段進行克隆，最后測定PCR鑒定的序列。

1.3 統計學方法

本次使用的統計軟件為 SPSS 19.0 ，建立數據庫并采用軟件包進行運算，以計量資料t來代表計算臨床數據并檢驗分析，以來進行單因素分析的檢驗，以P< 0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Taq Man熒光定量PCR檢測中的引物設計

在Taq Man熒光定量PCR檢測中，對比序列的同源性，選擇較為接近的基因片段，根據引物信息來設計序列，通過數據可以得出起始病毒數和PCR循環間存在相關性，顯示出可靠的擴增結果。HIV前病毒基因TaqMan熒光定量PCR檢測結果見表1。

表1 技術的構建

2.2 熒光定量PCR檢測的應用檢測結果

表2 TaqMan熒光定量PCR技術的樣品檢測

3 討 論

目前，HIV病毒攜帶者血漿中的病毒數量可以通過高效抗逆轉錄病毒療法來降低，從而在一定程度上控制艾滋病患者的臨床癥狀惡化，但由于高效抗逆轉錄病毒療法的療程相對較長，服藥期可長達數年至十數年以上，且不能停藥，否則艾滋病患者體內的HIV病毒數量會出現反彈[2]。如果患者患病癥狀惡化，那么可能面臨生命危險，而病毒數量出現反彈的原因可能在于HIV前病毒藏匿于患者體內細胞，HIV前病毒將人體細胞作為自身的溫床和藏匿場所，得以避開藥物的抑制作用，同時在適當條件下又會產生大量病毒排放到血漿中，形成惡性蔓延繁殖[3]。

感染較輕的CD4+T細胞所產生的病毒顆粒數量極少，只在T細胞核內卻嵌合(或非嵌合形式)病毒的基因物質導致潛伏性感染，經細胞內多次復制循環后靜息存在。HIV病毒以上述細胞為其屏障和滋生的病毒庫，形成繁殖循環在適宜環境下再次復制相當數量的病毒，以實現自身在血漿中的快速增值[4]。

在實驗中，靜息CD4+T細胞表面和活化T細胞表面分別有著陰性和陽性的CD25標志，所以可用此作為T細胞活化區分的標準。T細胞群被感染后對CD25+T細胞進行抑制，可降低HIV核心蛋白的表達量，因此可以推斷出CD25+T細胞是HIV前病毒的隱藏位置，采用Taq DNA聚合酶提高了準確性和檢出率，也使其PCR的污染得到降低。HIV前病毒PCR檢測在建立后與起始拷貝數和PCR循環數會有線性關系，可穩定擴增。具備特異性高的探針和引物，對病毒的LTR基因片段有針對性和重復性。

HIV的建立機制起于T淋巴細胞系，產生的LAV拷貝人體細胞中中的HIV基因，其HIV前病毒拷貝數可以借助于細胞計數得出，繼而實現HIV檢測建立。HIV FL片段在擴增后的長度大約在72 bp左右，其逆轉錄產物屬于病毒復制晚期，其復制程度適于體內前病毒時期。HIV的基因復制可以被當下使用的HAART療法在一定程度上得到控制，使得患者體內的HIV 血清水平得到降低。治療HIV時患者的HⅣ血清水平可以通過Taq Man熒光定量PCR技術對HIV前病毒進行檢測，對其RNA載量實現動態檢測以增進艾滋病的治療評價。建立完善的HIV前病毒系統檢測機制能夠剖析HIV感染原理，找到更為積極的防治措施，對于導向治療和設計藥物靶點有著實際的理論價值。

[1] 翟茂雄,唐 斌. HIV-1病毒儲存庫及檢測方法的研究進展[J].醫藥導報，2013(4)：362-363.

[2] 張啟順，紀瑞霞 .HIV-1耐藥性表型檢測方法研究進展[J].中國微生態學雜志，2014，2(28)： 65-66.

[3] 江 虹，陳壁亮 .SYBR+Green+I熒光定量PCR檢測HIV-1前病毒方法的建立及應用[J].中國醫藥導刊，2013，6(15)： 44-45.

[4] 向長茂. 柑桔潰瘍病菌實時熒光定量PCR檢測與應用[J].貴州醫藥，2011(1)：324-325.

本文編輯：王知平

溫 瑞，女，主管技師，從事微生物檢驗工作

R446.1

B

1671-0126(2017)03-0032-03