高糖引起H9C2心肌細胞增殖并高表達GATA4及β-MHC

阮駱陽，田小華，潘鳳娟，楊彩蘭，徐小紅

（廣東省農墾中心醫院兒科，廣東湛江524002）

高糖引起H9C2心肌細胞增殖并高表達GATA4及β-MHC

阮駱陽，田小華，潘鳳娟，楊彩蘭，徐小紅*

（廣東省農墾中心醫院兒科，廣東湛江524002）

目的：探討不同高糖濃度培養H9C2細胞導致心肌細胞增殖改變及可能機制。方法：體外培養H9C2大鼠心肌細胞分為6組，A-C組分別為：5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L葡萄糖培養基，各培養48 h；D-F組分別為：5mmol/L、25mmol/L、50mmol/L葡萄糖培養基，各培養72 h。MTT法檢測H9C2細胞增殖；qPCR法及Western blot法檢測β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）、GATA4的mRNA及蛋白表達。結果：OD值分別在培養48 h的A、B、C組及72 h的D、E、F組呈階梯上升，C、F組達到各自時段的最高點；同一葡萄糖濃度培養基培養48 h.和72 h后發現培養時長為72 h的OD值高于48 h。A、B、C組GATA4、β-MHC的mRNA及蛋白表達逐步升高，C組達最高；D、E、F組GATA4、β-MHC的mRNA及蛋白表達逐步升高，F組達最高。結論：高糖引起H9C2心肌細胞增殖并高表達GATA4、β-MHC。

心肌細胞；鋅指轉錄因子GATA4；β-重鏈肌球蛋白

代謝性疾病，如肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病都與心血管疾病如心肌肥厚和心力衰竭相關，糖尿病性心肌病的特點是心肌結構和功能的改變最終導致心力衰竭。多種機制參與了糖尿病性心肌病的發病，如心肌能量代謝和鈣信號的改變等。代謝障礙在糖尿病性心肌病的特點是脂質過氧化的增加，心肌內甘油三酯的積累，葡萄糖的利用降低，氧化應激增強等從而導致線粒體功能障礙與心肌細胞凋亡［1］。鋅指轉錄因子GATA4和β-重鏈肌球蛋白（β-MHC）與此高度相關，我們嘗試用高糖培養基培養H9C2大鼠心肌細胞，探索GATA4、β-MHC與代謝性心肌病的關系。

1 材料與方法

1.1 材料大鼠胚胎心肌細胞H9C2購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；胎牛血清購自Hyclone；DMEM-high glucose、DMEM-low glucose培養基均購自Gibco公司；PBS磷酸鉀緩沖液購自Hyclone；DNase I（RNase-free）（全式金）、Trizol試劑盒（Invitrogen，USA）、real-time PCR試劑盒（Vazyme）；GATA4、β-MHC一抗購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組A組：含10%胎牛血清的DMEM-常規培養基（糖濃度5mmol/L）培養48 h；B組：DMEM-高糖培養基（糖濃度25mmol/L）培養48 h；C組：DMEM-高糖培養基（糖濃度50mmol/L）培養48 h；D-F組：培養基成分分別與A、B、C組相同，培養時長均為72 h。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖取對數生長期細胞，EDTA胰蛋白酶溶液消化，800 r/min離心3 min，重懸，計數，稀釋細胞至數量為104～105個/ml左右，每孔加入100μl。根據細胞接種密度以及生長狀況，培養1～2 d。加入配好的含藥培養基100μl，每個濃度加注3個復孔，分別在CO2培養箱培養48 h、72 h后進行下一個步驟。吸去藥物，加入MTT溶液20μl，無血清培養基100μl，37℃孵育4 h，吸去上清，加150μl DMSO，振蕩10min，溶解結晶。測定492 nm波長處吸光度值。

1.2.3 熒光定量PCR法檢測各組心肌細胞GATA4、β-MHC的mRNA表達Trizol試劑盒提取RNA；使用RNase-free的DNase I配置反應液，37℃消化30min，65℃滅活10min去除DNA；取模板RNA（1.5μg）及引物混合物42℃反轉錄1 h，冰上2 min；cDNA稀釋10倍后，作為qPCR模板，加入引物反應體系，95℃1 s，60℃34 s；40個循環，在溫度60℃、95℃行融解曲線分析。GATA-4的上游引物序列為：CCTTGTCCAACACTCCCCTT，下游引物序列為GCCTTCTCCTCACCTAAACCC；ratβ-MHC的上游引物序列為AATGAACACCGGA GCAAGG，下游引物序列為CGGGTCAGCTGAGA GATAAGAGC；rat-GAPDH的上游引物序列為CATCAACGACC CCTTCATTG，下游引物序列為GAAGATGGTGA TGGGTTTCC。

1.2.4 Western-blot法檢測各組心肌細胞GATA4、β-MHC蛋白的表達培養孔板中的H9C2細胞經胰酶消化后，收集到Ep管中，再用PBS沖洗后立即放入預冷的裂解緩沖液中30min，10 000 r/min離心裂解產物20min，取上清。吸取2μl上清液用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，按序制備10ml 10%SDS-PAGE分離膠，5%濃縮膠5ml灌滿剩余空間，上樣50μg/孔。濃縮膠100 V恒壓電泳20min，分離膠140 V恒壓電泳40min。轉移已電分離的PAGE凝膠中的蛋白質至PVDF膜上，TBS洗滌3次后加封閉液置搖床室溫封閉2 h；膜放入封閉液稀釋的一抗中室溫反應4 h后4℃過夜，PVDF膜用大量PBST洗滌3次后放入二抗中室溫搖床2 h，取出，PBS洗5次，每次15min。化學發光法（ECL）顯影。

1.3 統計學處理采用GraphPad Prism 5軟件行統計分析，多組均數間的比較采用方差分析，顯著性檢驗水準取雙側P＜0.05。

2 結果

2.1 各組MTT實驗結果各組細胞分別培養48 h、72 h后，培養時長相同的各組OD值呈階梯上升，差異有統計學意義，C、F組達到最高。同一葡萄糖濃度培養基培養48 h和72 h后發現培養72 h者OD值均高于48 h，見圖1。

圖1 各組培養48 h、72 h MTT測定OD值

2.2 各組H9C2細胞GATA4、β-MHCmRNA的表達變化qRT-PCR檢測mRNA的表達，培養48 h后，B、C組GATA4和β-MHC的mRNA表達均較A組升高，差異有統計學意義；C組GATA4和β-MHC的mRNA表達較B組升高，差異有統計學意義；培養72 h后，E、F組GATA4和β-MHC的mRNA表達均較D組升高，差異有統計學意義。培養時長72 h較48 h相同糖濃度培養組GATA-4、β-MHCmRNA表達差異無統計學意義。見圖2。2.3 Western blot檢測各組H9C2細胞GATA4、β-MHC蛋白的表達培養48 h后，各組GATA4和β-MHC的蛋白表達均較A組升高，差異有統計學意義；GATA4和β-MHC的蛋白表達在A、B、C組逐步上升，C組達到最高點。分別培養72 h后，E、F組GATA4和β-MHC的蛋白表達均較D組升高，差異有統計學意義。培養時長72 h較48 h之間比較而言，相同糖濃度培養組GATA-4、β-MHC蛋白表達在兩時間點之間變化均不明顯見圖3。

3 討論

高血糖致心肌病的特點是心肌結構和功能的改變，最終導致心力衰竭。我們的前期研究發現高糖可導致H9C2細胞平均單個細胞體積增加，提示高糖培養可能通過激活Ca2+-CaN-NFAT3信號通路而導致H9C2細胞肥大［2］，同時也有研究證實GATA-4參與心肌肥厚的信號傳導［3］。為進一步研究其可能的信號通路，所以我們使用不同高糖濃度培養H9C2細胞不同時長來研究GATA-4通過何種機制產生對心肌肥厚的影響。

圖2 qRT-PCR檢測各組H9C2細胞GATA-4、β-MHCmRNA的表達

圖3 Western blot檢測各組H9C2細胞GATA-4、β-MHC蛋白的表達

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，主要用來測定細胞增殖及細胞活性。不同條件對H9C2細胞增殖的影響不同。Bi等［4］研究發現暴露于先低糖后高糖環境的H9C2細胞增殖下降。Gao等［5］研究發現法舒地爾可逆轉高糖誘導H9C2細胞增殖。Pang等［6］發現絲氨酸蛋白酶Corin表達可致高糖培養的H9C2心肌細胞增殖明顯下降。Huang等［7］研究發現丹酚酸B通過抑制高血糖合并缺氧條件下H9C2細胞凋亡達到保護效應。我們的研究則發現不同葡萄糖濃度下分別培養48 h、72 h后，相同時長各組細胞OD值隨糖濃度升高而呈階梯上升，總體比較差異有統計學意義，OD值在50mmol/L濃度組達到最高點。提示隨培養液糖濃度增加，細胞數目增加，與糖濃度呈正相關。同一糖濃度培養48 h和72 h后，時長為72 h者OD值均高于48 h，提示培養時長也是影響細胞增殖或活性的影響因素，培養時間越長，細胞利用轉化的能量物質越多，增殖越多，活性也相對增加。

鋅指轉錄因子GATA-4調節心臟形態發生和心肌細胞增殖，與先天性心臟病相關［8］。心肌細胞GATA-4調控著包括α-重鏈肌球蛋白（α-MHC）、β-MHC、心臟肌鈣蛋白-C、心房尿鈉因子（ANF）、腦尿鈉肽（BNP）、心臟肌鈣蛋白-I、A1腺苷受體、M2毒蕈堿性受體等多種基因和蛋白的表達。Ku等［9］發現高血糖通過誘導GATA-4磷酸化并在細胞核中的蓄積引起心臟收縮功能障礙。Pu等［10］也發現心臟發育對GATA-4的濃度非常敏感，濃度輕微改變就會引起顯著的下游信號波動，GATA-4負責監管心臟形態發生，GATA-4劑量和分級減少導致心臟發育異常如共同房室管、右心室雙出口的心室心肌發育不全，在正常情況下能指導心臟發育，在異常情況下則引起心臟發育畸形。目前的研究大多關注GATA-4對心肌細胞的分化、增殖的影響，也已有研究發現GATA-4是啟動心肌肥厚的重要轉錄因子［11］。但在對于高糖致心肌細胞肥大方面研究不多，因此我們觀察了GATA-4在高糖培養的H9C2細胞中表達變化并推測其可能的信號通路。我們的研究發現各組不同條件分別培養48 h、72 h后，5mmol/L、25mmol/ L、50mmol/L糖濃度培養組GATA-4mRNA、蛋白表達呈階梯式上升，差異有統計學意義；與細胞活性測定及細胞大小變化一致，提示GATA-4可能在高糖培養的H9C2細胞增殖、肥大中發揮作用。5 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L糖濃度培養組在兩時間點72 h和48 h之間GATAmRNA、蛋白表達變化不明顯。表明時間對GATA水平變化影響不大，可能在早期即發揮作用，隨時間延長作用未同步增加，在一定程度上印證了GATA為胎心發育早期的調控因子之一。

β-MHC基因是心肌肥大標記基因之一，β-MHC的mRNA和蛋白表達在一定程度上反映右心室肥大的改變［12］，被多項研究用來作為心肌肥大的指標［13-15］。我們的檢測結果顯示不同糖濃度培養48 h、72 h后，25mmol/L、50mmol/L糖濃度培養組β-MHCmRNA和蛋白表達均較5mmol/L糖濃度組升高，差異有統計學意義；50 mmol/L糖濃度培養組β-MHCmRNA和蛋白表達較25mmol/L糖濃度培養組升高，差異有統計學意義；提示高糖條件可導致心肌細胞增殖并可能致心肌肥大，隨糖濃度增高，心肌細胞增殖也明顯增強，推測高糖可導致心肌肥厚。相同糖濃度培養組在不同培養時長條件下心肌細胞增殖比較差異無統計學意義，說明培養時長對高糖培養的心肌細胞增殖影響不大。

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HighG lucose InducesH 9C2Cardiom yocyteProliferationbyRegulating theExpressionofGATA4andβ-MHC

RUAN Luoyang，TIANXiaohua，PAN Fengjuan，YANGCailan，XUXiaohong*
（DepartmentofPediatrics，The HospitalofGuangdong AgriculturalReclamation，Zhanjiang524002，China）

Objective：To inveatigate the effectofhigh glucose on H9C2 cardiomyocyte proliferation and its possiblemechanism. Methods thods：RatH9C2 cellswere divided into 6 groups.H9C2 cellswere incubated with 5mmol/L，25mmol/L，50mmol/L glucose for 48 h respectively in group A-Cand H9C2 cellswere incubated with 5mmo l/L，25mmo l/L，50mmo l/L glucose for 72 h in group DF.MTT assay was used to detect the proliferation of H9C2 cells.ThemRNA expression of GATA4 andβ-MHC in H9C2 cellswere detected by qRT-PCR and the protein levels of GATA4 andβ-MHC were detected by Western blot.Results sults：The OD values increased in the A-C group（A＜B＜C）for 48 h and in the D-F group for 72 h（D＜E＜F）（P＜0.05）.For the same glucose concentration，the OD valueswere significanthigher in cells cultured for 72 h than those in cells cultured for 48 h（B＜E，C＜F）. ThemRNA and protein expression ofGATA4 andβ-MHC also increased gradually in both groups（A＜B＜C，D＜E＜F），while there was no statistical difference between the two groups（P＞0.05）.Conclusion usion：High glucose can induce H9C2 cardiomyocyte proliferation by increasing theexpression ofGATA4 andβ-MHC.

cardiomyocyte；GATA4；β-MHC

R363

A

1008-2344（2017）03-0208-04

10.16753/j.cnki.1008-2344.2017.03.007

2016-12-01

（吳迪編輯）

徐小紅（1977—），女（漢），副主任醫師，研究方向：兒童代謝免疫系統疾病.E-mail：276798575@qq.com.