基于GC—MS的滸苔代謝產(chǎn)物提取方法研究

何艷麗 王延輝 陳方園 孫平飛 徐年軍

摘要 [目的]研究滸苔代謝產(chǎn)物的提取方法。[方法]以滸苔為研究對(duì)象，用不同的細(xì)胞破碎方式、溶劑提取體系、料液比等對(duì)均一樣本的代謝產(chǎn)物進(jìn)行提取，氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）鑒定代謝產(chǎn)物成分，利用主成分分析等方法，對(duì)不同的代謝提取體系進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]溶劑體系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮處理-球磨破碎-超聲波的破壁方法提取并鑒定出81種代謝產(chǎn)物，該方法具有高提取產(chǎn)率、高重現(xiàn)性、易操作和速度快等優(yōu)點(diǎn)。[結(jié)論]溶劑體系甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）和液氮處理-球磨破碎-超聲波破壁是適合滸苔代謝物提取的方法，該方法可為滸苔及大型綠藻的代謝組學(xué)研究提供參考。

關(guān)鍵詞 滸苔；提取方法；氣相色譜-質(zhì)譜；代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào) S986.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）13-0072-04

Metabolite Profiling of Seaweed Enteromorpha Using Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HE Yan-li1，2， WANG Yan-hui1， CHEN Fang-yuan1， XU Nian-jun2* et al

（1. School of Pharmaceutical Engineering， Zhejiang Pharmaceutical College， Ningbo， Zhejiang 315100； 2. School of Marine Sciences， Ningbo University， Ningbo， Zhejiang 315211）

Abstract [Objective] To study the extraction method of Enteromorpha metabolites. [Method] Enteromorpha as the research object， using different cell crushing methods， solvent extraction system， solid-liquid ratio， the homogeneous sample metabolites were extracted； the metabolites were identificated by GC-MS； using principal component analysis method， different metabolic extraction systems were evaluated. [Result] A total of 81 metabolites were extracted and identified by the solvent system of methanol∶chloroform∶water （7∶3∶3） and liquid nitrogen treatment-milling-ultrasonic breaking method， showing high extraction yield， high reproducibility， easy operation and fast and other characteristics. [Conclusion] It is a suitable method for extracting metabolites of Enteromorpha which can provide reference for metabonomics study of Enteromorpha and large green algae.

Key words Enteromorpha；Extraction method；GC-MS；Metabolite

滸苔（Enteromorpha）亦稱苔條、苔菜，屬綠藻綱石莼科，為大型海洋綠藻，廣溫、廣鹽、耐干旱，在我國近海廣泛分布。在適合條件下容易出現(xiàn)爆發(fā)型增殖，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重困擾，其生態(tài)危害受到廣泛關(guān)注。同時(shí)滸苔又有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，滸苔“燒末吹鼻止衄血，湯浸搗敷手背腫痛”，具有軟堅(jiān)散結(jié)、化痰消積、解毒消腫等作用；滸苔富含蛋白質(zhì)、纖維素、碳水化合物和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分，在日韓等國家作為中高檔的佐料消費(fèi)[1]，且價(jià)格昂貴。

滸苔在近海中的綠潮爆發(fā)極具規(guī)律：每年4、5月份在山東、江蘇、浙江等局部海域爆發(fā)，爆發(fā)期間對(duì)當(dāng)?shù)厮a(chǎn)養(yǎng)殖造成極大損失[2]，對(duì)近海環(huán)境也產(chǎn)生不良影響，而其他時(shí)間附近海域則較少出現(xiàn)。關(guān)于其爆發(fā)機(jī)制以及如何減少其危害、提高對(duì)其有效利用仍需深入研究。近年來對(duì)滸苔的研究逐漸增多，但主要集中在其生理和繁殖狀態(tài)觀察方面[3-4]，滸苔綠潮爆發(fā)情況下，滸苔代謝組的研究還未見報(bào)道。

代謝組學(xué)為分析植物細(xì)胞活動(dòng)、次生代謝網(wǎng)絡(luò)提供了依據(jù)[5-7]。近年來隨著相關(guān)數(shù)據(jù)處理軟件和植物代謝組數(shù)據(jù)庫的完善，代謝組學(xué)的應(yīng)用成為植物代謝通路研究不可或缺的一部分，其提取方法直接影響試驗(yàn)結(jié)果[8-9]，而不同物種的植物代謝產(chǎn)物具有一定的物種特異性，因此，建立并優(yōu)化基于氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）的滸苔代謝產(chǎn)物提取方法很有必要。

筆者通過比較不同的細(xì)胞破碎方法和提取溶劑等提取因素，對(duì)適合滸苔水相代謝產(chǎn)物的提取方法進(jìn)行優(yōu)化；通過該方法，測(cè)定并解析基于GC-MS的滸苔中基本的代謝圖譜，為后續(xù)的滸苔代謝組研究和類似的大型海洋綠藻的代謝組研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 主要試劑：三氯甲烷、正己烷、石油醚、甲醇、均為色譜級(jí)試劑，購自 Thermo Fisher公司；衍生化試劑N-甲基-三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA），購自Aldrich。

主要儀器：GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀（Trace1300-ITQ900，賽默飛，美國）；色譜柱為TR-5ms 弱極性色譜柱（30 m×0.25 μm×0.25 mm）；JXFSTPRP-24球磨儀，上海凈信科技；CV200冷凍旋轉(zhuǎn)蒸干儀，北京艾吉姆。

1.2 方法

1.2.1 藻種及培養(yǎng)方法。

滸苔分離自象山港塔頭旺近海海域，加冰并在5 h內(nèi)運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。正式試驗(yàn)前進(jìn)行純化培養(yǎng)，采用人工海水，鹽度30， f/2培養(yǎng)基（不加硅）加富，溫度為（25.0±0.5）℃，光照強(qiáng)度為 4 000 lx，光暗周期12 h∶12 h，隔天換水。

1.2.2 代謝物提取方法。2種細(xì)胞破碎方法：a.液氮研磨-超聲波；b.液氮處理-球磨破碎-超聲波。此處的液氮處理為樣品取出后，加入液氮用于酶等生物活性物質(zhì)的滅活，不研磨。3種溶劑體系：①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；②甲醇-水（7∶3）；③甲醇-正己烷-三氯甲烷-水（1∶1∶1∶1）。采用上述2種破碎方法和3種溶劑體系提取滸苔代謝產(chǎn)物。

具體操作如下：準(zhǔn)確稱取 20 mg滸苔凍干樣品（n=3），采用液氮研磨后，加入1 mL提取溶劑，冰浴超聲波1 min停頓1 min，重復(fù)10次。與3種溶劑組合后優(yōu)選出最佳溶劑組合后，分別結(jié)合3種細(xì)胞破碎方法，選擇最佳細(xì)胞破碎方式，最后進(jìn)行料液比試驗(yàn)。

1.2.3 GC-MS測(cè)試條件。柱前衍生，衍生條件：揮干有機(jī)相→加入50 μL甲氧氨基化試劑（甲氧氨基鹽酸鹽，20 mg/mL吡啶溶液）→30 ℃振蕩孵化90 min→加入90 μL MSTFA衍生化試劑→37 ℃恒溫孵化30 min→室溫放置2 h。

進(jìn)樣口溫度250 ℃，不分流進(jìn)樣，流速1.0 mL/min。程序升溫：50 ℃保留3 min，10 ℃/min 到250 ℃，保留5 min。傳輸線溫度250 ℃，EI源溫度230 ℃，質(zhì)荷比35～500。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑提取優(yōu)化

以提取代謝物種類、有效峰面積為指標(biāo)，對(duì)不同的溶劑提取體系進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。液氮研磨后分別采用3種溶劑體系提取。結(jié)果如圖1和圖2所示，組合a②提取的物質(zhì)較少，只有61種，a①和a③較多，溶劑體系①和③提取物質(zhì)種類沒有顯著差異，但③中雜峰較多，有效峰面積僅為72%，因此，選擇①甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）作為提取溶劑。

2.2 細(xì)胞破碎方式的選擇及料液比優(yōu)化

以提取的代謝產(chǎn)物種類、有效峰面積和重現(xiàn)性為依據(jù)，對(duì)細(xì)胞破碎方式進(jìn)行優(yōu)化。由圖3可以看出，液氮研磨-超聲波破碎細(xì)胞的提取物質(zhì)種類較多，平均為82種，但其與液氮處理-球磨儀-超聲波處理方法提取的物質(zhì)總數(shù)沒有顯著差異。

重現(xiàn)性：圖4中， b1～b8為同一組樣品的重復(fù)，a1～a9為同一樣品的重復(fù)。在主成分分析圖中，每個(gè)樣品數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)一個(gè)點(diǎn)， 樣品數(shù)據(jù)越相似，其在主成分分析圖上對(duì)應(yīng)的點(diǎn)之間的距離就越近，其集中程度反映了處理樣品重現(xiàn)性的高低。理想狀態(tài)下，b1～b8 和a1～a9分別集中在一起，從圖4可以看出，三角形和正方形分布于中間軸的兩側(cè)，說明2組差異顯著。b1～b8高度集中，而a1～a9分散于右邊半個(gè)區(qū)域，即方法a①組內(nèi)差異明顯比方法b①大。這可能是液氮研磨是人工手動(dòng)，當(dāng)樣品數(shù)量多時(shí)，對(duì)人力消耗較大，造成研磨重現(xiàn)性差。另外，由于液氮研磨是將樣品直接置于研缽中，研磨過程會(huì)損耗一部分樣品，樣品量少的情況不適合用該種方法。球磨儀破碎和超聲波破碎細(xì)胞時(shí)，可以將樣品稱重后放EP管中，破碎后直接加入萃取溶劑，避免了二次轉(zhuǎn)移，減少了對(duì)樣品的損耗，對(duì)樣品量的要求降低。另外，利用球磨儀破碎時(shí)采用了批量處理，這應(yīng)該是其組內(nèi)差異小的原因之一。基于此，將樣品前期用液氮滅活，然后采用球磨儀和超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎的方法是較好的代謝組細(xì)胞破壁方法。

2.3 滸苔代謝產(chǎn)物分析

經(jīng)Nist數(shù)據(jù)庫比對(duì)，結(jié)合已有文獻(xiàn)[5]和Massbank數(shù)據(jù)庫參考，分析并鑒定提取滸苔代謝產(chǎn)物81種。其中，氨基酸18種，含量占11.511%，涵蓋常見的必需氨基酸和非必需氨基酸；酸類24種，含量11.600%，主要是參與三羧酸循環(huán)的小分子羧酸，為重要的代謝組分；糖類10種，含量67.78%；另有芳香酸、醇類、萜、烯醇等。

3 結(jié)論與討論

通過比較不同的細(xì)胞破碎方法和提取溶劑等提取因素，發(fā)現(xiàn)選擇提取溶劑采用甲醇-三氯甲烷-水（7∶3∶3）；細(xì)胞破壁方法采用將樣品前期用液氮滅活，然后采用球磨儀和超聲波進(jìn)行細(xì)胞破碎得到的代謝產(chǎn)物較多（81種），平行性和重復(fù)性都較另外幾種方法穩(wěn)定，GC-MS分離鑒定出24種酸、10種糖、18種氨基酸等物質(zhì)。

溶劑提取方法的結(jié)果與張曉飛等[10]的研究結(jié)果相近，這說明植物中一部分代謝產(chǎn)物相對(duì)保守，但是3種溶劑的比例不同，可能因?yàn)檫@2種植物中的極性和非極性的代謝產(chǎn)物比例不同。該提取方法與分類提取的差異不大，有些甚至還由于單獨(dú)分類提取：如齊曉輝等[11]等提取滸苔多糖，最后得到12種，該試驗(yàn)得到了10種；提取和分離鑒定的氨基酸中谷氨酸含量較高，這與徐大倫[12]的研究相近，并且該方法提取的氨基酸為18種，比徐大倫的提取方法多了1種；該方法分離鑒定出的24種酸中，其中亞麻酸含量較高，這與孫偉紅等[13]的研究結(jié)果相同。綜上，該方法對(duì)不同種類小分子代謝物得到了比較充分的提取，為進(jìn)一步研究滸苔代謝奠定基礎(chǔ)。

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