姜黃素改善糖尿病心肌病大鼠心室重構及機制的研究

熊雪松，戚忠林

姜黃素改善糖尿病心肌病大鼠心室重構及機制的研究

熊雪松，戚忠林

目的 探索姜黃素對糖尿病心肌病(DCM)大鼠血糖及抑制心室重構的影響。方法 雄性Wistar大鼠40只，適應性喂養1 周后，隨機分為對照組(n=10) 、模型組(n=10)、姜黃素組(n=10)和陽性對照組(n=10)。采用高脂高熱量飲食+單次40 mg/kg鏈脲佐菌素腹腔注射建立DCM動物模型，姜黃素組大鼠給予姜黃素注射液30 mg/(kg·d)腹腔注射；陽性對照組大鼠給予40 mg/(kg·d)柚皮苷灌胃，對照組及模型組大鼠腹腔注射等量6%乙醇和6%聚乙二醇混合液，各組大鼠連續用藥8周。檢測各組大鼠給藥前后血糖變化；給藥8周后行高頻超聲心動圖檢查，測定各項心功能指標；處死大鼠，取心臟，行HE、Masson染色進行心肌組織膠原容積分數分析。TUNEL法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡；ELISA法檢測各組大鼠心室肌中基質金屬蛋白酶(MMP)-9及MMP-2表達，并用HemI軟件進行熱圖分析；Western blot檢測各組大鼠心肌組織中GRP78、IRE1、JNK及p-JNK表達。結果 與模型組相比，姜黃素組大鼠給藥8周后血糖明顯降低(P<0.05)，心臟彩超結果顯示左室重構各項指標均有明顯改善(P<0.05)；姜黃素組大鼠心肌纖維化病理積分及纖維化相關因子MMP-9及MMP-2表達明顯下降(P<0.05)；姜黃素組大鼠心肌組織GRP78、IRE1、JNK及p-JNK表達及細胞凋亡明顯減少(P<0.05)。結論 姜黃素可以通過降低DCM大鼠血糖、減輕心肌纖維化、抗心肌細胞凋亡等多個方面起到抑制DCM大鼠心室重構的作用。

糖尿病心肌病；姜黃素；凋亡；纖維化；心室重構

糖尿病心肌病(DCM)是由糖尿病引起的嚴重心肌病變，主要表現為心臟結構和功能異常，最終引發心力衰竭或心源性猝死，也是糖尿病病人的重要致死原因之一[1]。現階段認為，DCM的主要發病機制為心肌纖維化、心臟自主神經病變、心肌代謝紊亂及心肌細胞凋亡[2-4]。姜黃素是從姜科植物中提取的一種黃色酚類化合物，姜黃素對糖尿病大鼠心肌具有保護作用[5]。本研究復制2 型糖尿病大鼠模型，探討姜黃素逆轉DCM大鼠心室重構的作用，以期為姜黃素治療糖尿病心肌病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥品、材料與儀器 姜黃素(陜西森弗生物技術有限公司，中國)；MP150多導生理記錄分析儀(BIAPOC，美國)；光學顯微鏡( Olympus，日本)；MMP-9、MMP-2 ELISA試劑盒購(欣博勝，中國)；WD-9405B水平搖床(六一公司，中國)；anti-GRP78、anti-IRE1、anti-JNK、anti-p-JNK及GAPDH內參抗體(ABCAM公司)；TUNEL試劑盒(碧云天，中國)；鏈脲佐菌素(Sigma，美國)；WD-9413B凝膠成像系統(北京六一，中國)。

1.2 動物分組及模型制作 成年雄性Wistar大鼠40只，體重220 g±15 g，大鼠生長條件為22℃，正常飲食，日照時間為12 h/d，實驗室通風較好，濕度為40%～55%，大鼠均自由進食、飲水，適應環境1周。將大鼠隨機分為4 組，分別為對照組(n=10)、模型組(n=10)、姜黃素組(n=10)及陽性對照組(10)。采用鏈脲佐菌素腹腔注射法制作糖尿病動物模型，制成1% 鏈脲佐菌素溶液 (溶解于pH4.5枸櫞酸緩沖液中)，模型組、姜黃素組及陽性對照大鼠進行單次40 mg/kg腹腔注射，并給予高脂高熱量飲食，在造模3 d和7 d后，禁食12 h后，由尾靜脈采血0.5 mL，并檢測血糖。成模標準： 注射后72 h非同日連續3次測定血糖均≥16.7 mmol/L為造模成功，未達成模標準者剔除。姜黃素組在糖尿病動物模型建立成功后，給予姜黃素注射液(姜黃素溶于6%乙醇和6%聚乙二醇混合液)30 mg/(kg·d)腹腔注射，對照組和模型組大鼠腹腔注射等量6%乙醇和6%聚乙二醇混合液[6]，陽性對照組在高脂高熱量喂養基礎上給予柚皮苷40 mg/(kg·d)溶于蒸餾水中灌胃[7]，連續用藥8周。

1.3 檢測大鼠血糖 在實驗前及給藥8周后各組大鼠禁食12 h，通過尾靜脈采血，檢測各組大鼠血糖變化。

1.4 心臟超聲心動圖的測定 給藥8周后，使用GE Vivid E9彩色超聲顯像儀，對每組大鼠進行經胸心臟超聲心動圖檢查。經胸壁高頻超聲ML6-15探頭，頻率13 MHZ，圖像深度3.5 cm。10%水合氯醛0.2 g/kg腹腔注射麻醉大鼠，在二維超聲引導下，M型超聲測定胸骨旁左心長軸切面室間隔厚度(IVSd)、左心室舒張期內徑(LVIDd)及舒張末期左室后壁厚度(LVPWd)，每個測定值均取4個連續完整心動周期測量平均值[8]。

1.5 病理取材及切片制作 心臟超聲心動圖檢查后，立即處死大鼠，在無菌狀態下用眼科剪將大鼠左肋剪開，充分暴露心臟后將心臟取出，保留一部分心室肌組織并投入到固定液中(4%多聚甲醛溶液)，經乙醇脫水、石蠟包埋后，置于切片機中連續切片，經脫蠟、二甲苯透明后進行HE及Masson染色，分別于不同倍數光鏡下觀察各組大鼠心肌病理變化，用Image J圖像分析軟件對Masson染色圖片進行心肌組織膠原容積分數(CVF)分析，CVF=膠原面積/總面積。其余心室肌組織部分制作組織勻漿用于檢測實驗相關蛋白。

1.6 TUNEL檢測心室肌細胞凋亡 各組大鼠心室肌組織經過0.1%Trition X-100透化后，用PBS漂洗3次，每次漂洗5 min，再滴加3%H2O2200 μL，漂洗3次后，加入蛋白酶K工作液置于常溫下20 min；漂洗3次后加入TUNEL反應液(TdT+熒光素標記的dUTP)37 ℃恒溫箱中避光孵育60 min；PBS清洗3次后加入DAPI，再次應用PBS漂洗3次，最后防熒光淬滅封片劑封片。隨機移動組織切片，選取細胞分布較均勻的高倍視野計數1 000 個以上，在相鄰的10個視野下，紅褐色細胞即陽性細胞。凋亡指數計算：凋亡指數(AI)=各視野陽性細胞數/視野所有細胞總數×100%。

1.7 檢測大鼠心室肌組織MMP-9及MMP-2表達 ELISA法檢測各組大鼠心室肌組織勻漿中MMP-9、MMP-2表達，嚴格按照說明書操作[9]。將ELISA法測得的數據導入Heml軟件[10]，對MMP-9、MMP-2進行熱圖分析。

1.8 Western blot檢測各組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、JNK及p-JNK的表達 Western blot檢測步驟：蛋白質抽提→蛋白質定量→SDS-PAGE→轉印至PVDF膜→封閉→孵育一抗(一抗濃度1∶200)→孵育二抗(二抗濃度1∶500)→ECL底物發光→圖像保存。普通抗體的封閉液、一抗孵育液、二抗孵育液為5%脫脂奶粉溶液。檢測各組心肌組織中GRP78、IRE1、JNK及p-JNK的表達[11]。

2 結 果

2.1 各組大鼠成活率及成模率 對照組和陽性對照組無死亡；模型組于造模后3周死亡2只，姜黃素組于造模4周死亡1只。各組大鼠造模數量、成模數量及造模成功率見表1。

表1 各組大鼠成活率及成模率

2.2 各組大鼠血糖變化 與對照組相比，模型組及姜黃素組大鼠給藥前與給藥8周后，血糖均高于對照組(P<0.05)；與模型組相比，姜黃素組及陽性對照組給藥前血糖差異無統計學意義，但給藥8周后血糖明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 姜黃素對DCM大鼠血糖的影響(±s) mmol/L

2.3 各組大鼠高頻心臟超聲測定結果 與對照組相比，模型組室間隔厚度(IVSd)、左室后壁厚度(LVPWd)明顯增厚，左室舒張末內徑(LVIDd)明顯增大(P<0.05)，提示模型組大鼠心室肌增厚，心腔擴大，符合DCM所致心室重構特點。與模型組相比，姜黃素組和陽性對照組大鼠IVSd、LVPWd增厚減輕，LVIDd明顯改善(P<0.05)。詳見圖1、表3。

注： A為對照組； B為模型組； C為姜黃素組； D為 陽性對照組。

圖1 各組大鼠心臟超聲變化

表3 各組大鼠高頻心臟超聲數值變化(±s) mm

2.4 病理學改變

2.4.1 心臟大體改變 對照組術后大鼠心臟外觀無明顯異常。模型組大鼠心臟顏色雖無明顯變化，但心室明顯擴大，且觸及心室肌質地較硬，彈性較差。姜黃素組和陽性對照組大鼠心臟外觀基本正常，質地較模型組有彈性，但與對照組相比仍彈性稍差。

2.4.2 HE染色結果 光鏡下觀察HE染色結果：與對照組相比，模型組心室肌纖維增粗，心肌纖維間隔增寬，細胞核排列紊亂，可見大量淋巴細胞浸潤現象；姜黃素組和陽性對照組大鼠大部分心肌纖維排列整齊，間隙緊密有序，少數心肌細胞核固縮。詳見圖2。

注： A為對照組； B為模型組； C為姜黃素組； D為 陽性對照組。

2.4.3 Masson染色結果 Masson染色結果中膠原纖維呈藍色，細胞質、肌纖維和紅細胞呈紅色，細胞核呈藍褐色。對照組大鼠心室肌組織只見少許纖維組織并且呈均勻分布，CVF為(2.85±0.11)%，模型組大鼠可見大量纖維組織，聚集于血管和心肌細胞周圍，CVF為(14.86±1.29)%，與對照組相比心室肌組織纖維化嚴重(P<0.05)；姜黃素組大鼠心室肌CVF為(7.23±0.33)%，陽性對照組大鼠心室肌CVF為(5.23±0.38)%，與模型組比較，心肌纖維化程度明顯降低(P<0.05)。詳見圖3。

注： A為對照組； B為模型組； C為姜黃素組； D為 陽性對照組。

2.5 TUNEL法檢測各組大鼠心室肌細胞凋亡 對照組大鼠心室肌細胞僅有少量凋亡細胞(AI=2.78±1.14)，與對照組相比較，模型組大鼠凋亡明顯(AI =21.66±2.1)，有統計學意義( P<0.01)；與模型組大鼠相比較，姜黃素組(AI=7.43±0.72)和陽性對照組大鼠(AI=9.66±1.18)心室肌細胞凋亡細胞量明顯減少(P<0.01)。詳見圖4。

注： A為對照組； B為模型組； C為姜黃素組； D為陽性對照組。

2.6 各組大鼠心室肌組織MMP-9及MMP-2表達 對照組大鼠心室肌組織中MMP-9表達量(103.97±11.3)ng/mL，模型組大鼠心室肌組織中MMP-9表達量(354.76±28.46)ng/mL，模型組與對照組相比明顯升高(P<0.05)；而姜黃素組大鼠心室肌MMP-9表達量(154.23±20.7)ng/mL，陽性對照組MMP-9表達量為(118.42±9.03)ng/mL，與模型組相比明顯減低(P<0.05)。對照組大鼠心室肌組織中MMP-2表達量(143.46±12.53)ng/mL，模型組大鼠心室肌組織中MMP-2表達量(264.66±19.72)ng/mL，與對照組相比明顯升高(P<0.05)；而姜黃素組大鼠心室肌MMP-2表達量(154.23±10.89)ng/mL，陽性對照組MMP-2表達量為(148.41±12.63)ng/mL，與模型組相比明顯減低(P<0.05)。MMP-9、MMP-2進行熱圖分析，途中藍色越接近-1端藍色為低表達，越接近1端紅色為高表達，黑色框為無數據表示。詳見圖5。

圖5 各組大鼠心室肌組織中MMP-9及MMP-2表達差異熱圖

2.7 各組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、JNK和p-JNK的表達 與對照組相比，模型組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、JNK及p-JNK表達升高，有統計學意義(P<0.01)；與模型組相比，姜黃素組、陽性對照組大鼠心室肌組織中GRP78、IRE1、JNK及p-JNK均明顯降低(P<0.01)。詳見圖6、表4。

注： A為對照組； B為模型組； C為姜黃素組； D為陽性對照組。圖6 各組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、JNK和p-JNK的表達表4 各組大鼠心室肌組織GRP78、IRE1、JNK及p-JNK相對表達比較(±s)

3 討 論

DCM是糖尿病的獨立并發癥之一，其主要的發病原因為高血糖造成心肌微小血管損害，從而使心肌組織彌漫性損傷。持續高血糖狀態對心肌細胞造成嚴重損傷，繼而發生心肌細胞凋亡、心肌組織纖維化等心室重構病理變化，最終導致心力衰竭甚至死亡事件發生。國外學者研究發現[12]，DCM大鼠心肌間質存在明顯的纖維化，心肌組織中MMP-2、MMP-9及凋亡相關因子表達升高，而心功能下降。由此可見，逆轉心室重構，減輕心肌組織纖維化程度、減少心肌細胞凋亡有可能成為治療DCM的關鍵因素。內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)是近年來新發現的細胞凋亡通路，ERS發生后，內質網通過上調分子伴侶蛋白GRP78表達、抑制蛋白質合成、加速錯誤折疊和未折疊蛋白質降解等方式緩解ERS，然而持續或較嚴重的ERS 則觸發凋亡信號。對于ERS及其相關信號通路參與DCM發病機制的相關研究國內鮮有報道。

姜黃素用于治療糖尿病由來已久，1972年Srinivasan最早研究發現，姜黃素對血糖有控制作用。而近年來學者們陸續發現姜黃素對于DCM具有抗纖維化、抗炎、抗凋亡及改善高血糖引起的氧化應激和葡萄糖轉運蛋白功能缺陷等作用[13-15]。但姜黃素在JNK信號通路所引起內質網應激介導DCM心肌細胞凋亡尚未見報道。本研究觀察姜黃素對JNK信號通路、DCM心肌細胞凋亡及DCM心室重構的影響，并以柚皮苷為陽性對照組，探討姜黃素對DCM大鼠心肌的保護作用。

本研究造模后首先檢測血糖及多普勒心臟超聲證實DCM大鼠造模成功，心臟超聲顯示IVSd、LVPWd明顯增厚，LVIDd明顯增大，與病理取材后心臟大體形態結果相一致。同時發現姜黃素可以使DCM組大鼠心肌纖維排列紊亂得到明顯改善，變性，壞死心肌細胞減少，心肌細胞間質水腫減輕，間質纖維化明顯減少，纖維化相關因子MMP-9和MMP-2表達明顯減少，這與Masson染色結果趨勢相同；說明姜黃素可能通過降低大鼠心肌組織中重塑細胞外基質的關鍵因子MMP-9、MMP-2從而減輕心肌纖維化，這與李香波的研究結果相似[3]。為了深入研究姜黃素對DMC大鼠心肌的作用，本研究應用TUNEL法檢測細胞凋亡情況，結果發現姜黃素可有效減少DCM大鼠心肌細胞凋亡數量，進一步采用Western blot檢測內質網應激標志物GRP78，ERS凋亡信號通路因子IER1、JNK及p-JNK，證實姜黃素與柚皮苷作用相似，通過降低GRP78、IER1、JNK及p-JNK的表達，而起到減少細胞凋亡的作用。

本實驗結果只能部分解釋姜黃素逆轉心室重塑，改善DCM大鼠心室重構的作用機制，至于不同劑量姜黃素對于DCM大鼠心肌組織及其他ERS凋亡信號通路或的影響，則有待下一步實驗加以闡明。

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(本文編輯王雅潔)

Effects of Curcumin on Ventricular Remodeling in Diabetic Cardiomyopathy Rats and Its Mechanism

Xiong Xuesong， Qi Zhonglin

Ezhou Central Hospital， Ezhou 436000，Hubei，China

Objective To explore the effects of curcumin on blood glucose and ventricular remodeling in diabetic cardiomyopathy rats (DCM).Methods Forty male wistar rats were randomly divided into control group (n=10)， model group (n=10) ， curcumin group (n=10)，and positive control group(n=10) after one week of adaptive feeding.The high-fat high-calorie diet plus single chain of 40 mg/kg streptozotocin with intraperitoneal injection were used to establish animal model of DCM， rats in curcumin group and positive control group rats were given intragastric administration of 40 mg/(kg·d) naringin；6% ethanol and 6% polyethylene glycol mixture rats in control group and model group intraperitoneal， administrated 8 weeks.Rats in each group were measured for blood glucose changes before and after drug administration；after 8 weeks of administration， the heart function indexes were measured by high frequency echocardiography；then the rats were sacrificed.The myocardial tissue was taken for HE staining，Masson for collagen volume fraction analysis.Apoptosis of myocardial cell were detected by TUNEL.The expressions of matrix metalloproteinase (MMP)-9 and MMP-2 were detected by ELISA in myocardium of rats， and image analysis by HemI software.The expression of GRP78， IRE1， JNK and p-JNK in rat myocardium were detected by western blot.Results Compared with the model group， the rats in curcumin group after 8 weeks of administration， the blood glucose decreased significantly (P>0.05).The echocardiography showed that left ventricular remodeling indicators were significantly improved(P<0.05).The myocardial fibrosis integral and MMP-9 and MMP-2 expressions were significantly decreased in curcumin group (P<0.05).The expressions of GRP78， IRE1， JNK,p-JNK and cell apoptosis were significantly reduced in myocardial tissue of the rats in curcumin group(P<0.05).Conclusion Curcumin can decrease the blood glucose of DCM rats， reduce myocardial fibrosis， anti-myocardial cell apoptosis，inhibit ventricular remodeling in DCM rats.

diabetic cardiomyopathy；curcumin；apoptosis；fibrosis；ventricular remodeling

湖北省鄂州市中心醫院(湖北鄂州436000)，E-mail：EZxiongxuesong@163.com

信息：熊雪松，戚忠林.姜黃素改善糖尿病心肌病大鼠心室重構及機制的研究[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1445-1450.

R587 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.007

1672-1349(2017)12-1445-06

2017-02-19)