左乙拉西坦對硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的影響

吳建坤，牛爭平

左乙拉西坦對硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的影響

吳建坤1，牛爭平2

目的 觀察左乙拉西坦(LEV)對硝酸甘油所致偏頭痛大鼠行為學及對高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的影響，探討左乙拉西坦對偏頭痛的防治作用以及可能的作用機制。方法 將24只健康雄性SD大鼠普通喂養1周，采用分層隨機法，將其分成假模型組(6只)和模型組(18只)。制作實驗性偏頭痛大鼠模型，造模成功后再將模型組大鼠隨機分為模型對照組(6只)、LEV低劑量干預組(6只)及LEV高劑量干預組(6只)。各組按照實驗設計分別給予生理鹽水及LEV不同劑量灌胃。造模成功后觀察大鼠在行為學方面的改變。30 min作為一個觀察時間單元，采取持續時間分段計數的方式觀察90 min內各個時間段的大鼠撓頭、爬籠和甩頭的次數。復制偏頭痛模型3 h后，給予腹腔注射麻醉，進行甲醛灌注，取頸髓1-2。用免疫組化方法對谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)染色，然后用光學顯微鏡觀察谷氨酸和GABA免疫陽性細胞的表達情況，并在同側脊髓后角部位隨機選取5個高倍視野，依次記錄陽性細胞數。結果 行為學變化：與假模型組對照，其余各組大鼠的撓頭次數、爬籠次數和甩頭次數在各個時間段內均呈現明顯增加(P<0.05)。與模型對照組比較，LEV干預組大鼠撓頭次數、爬籠次數和甩頭次數均隨著給藥劑量的升高而降低。谷氨酸和GABA免疫陽性細胞表達：與假模型組比較，其余各組的谷氨酸免疫陽性細胞表達明顯增多(P<0.05)，GABA免疫陽性細胞表達明顯減少(P<0.05)；與模型對照組比較，LEV低、高劑量干預組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應陽性細胞表達明顯降低(P<0.05)，GABA免疫陽性細胞表達明顯增多(P<0.05)，且呈劑量依賴性。結論 LEV可以改善偏頭痛大鼠在行為學方面的變化，能使高頸髓谷氨酸能中間神經元的表達降低，GABA能中間神經元的表達增強，且呈劑量依賴性,其機制可能與調節頸髓中間神經元“興奮-抑制”穩態的平衡有關。

偏頭痛；左乙拉西坦；中間神經元；谷氨酸；γ-氨基丁酸

左乙拉西坦(levetiracetam,LEV,商品名：開浦蘭)為吡拉西坦類藥物，主要用于治療癲癇，并且有較好的臨床效果。目前已有大量研究指出左乙拉西坦可用于治療偏頭痛、雙向心境障礙及神經痛[1]。Krusz首次發現左乙拉西坦在防治偏頭痛方面有一定的療效，但其詳細機制仍不清楚。

偏頭痛屬于原發性頭痛疾病，臨床常為反復發作的、搏動性的頭痛，多呈單側，常伴惡心和嘔吐，部分病人發作前可有視覺、感覺障礙等先兆。慢性偏頭痛給個人及社會帶來嚴重的生活和心理負擔，但其潛在的機制尚不完全清楚[2]。有些偏頭痛病人在臨床上訴有頸部肌肉的僵硬、痙攣或者疼痛等[3]，這些癥狀甚至先于頭痛的發生，因此處理偏頭痛病人的頸部癥狀已成為臨床需求。然而，目前很少有把此兩者相結合研究的報道。

顱內硬腦膜初級感覺神經元的激活、脊髓傷害感受性神經元的興奮性增高及敏化為偏頭痛發生的關鍵環節，這種脊髓傷害感受性神經元的高反應性稱為“中樞敏化”[4]。中樞敏化在偏頭痛的發作中起著重要作用，有研究顯示頭痛可使頸部肌肉產生異常的運動反應，三叉神經-頸反射(trigeminocervical reflex，TCR)[5]所產生的改變即探究了三叉神經頸復合體的傷害性信息傳遞，為疼痛的中樞機制提供了組織解剖基礎，也揭示了疼痛信息在周圍與中樞之間的轉化可能傳導通路和機制。對于脊髓水平中樞敏化，有文獻報道其可能的機制為中間神經元的改變[6]。中間神經元包括興奮性中間神經元和抑制性中間神經元，分別以谷氨酸(glutamate，Glu)和γ-氨基丁酸(gamma amino acid butyric acid，GABA)為代表發揮效應，并把感覺神經元和運動神經元聯系在一起。有研究證實，GABA與疼痛信息的處理有關，GABA能中間神經元產生的抑制性信號傳入障礙可導致感覺神經元和運動神經元的興奮性升高[7]。

對于偏頭痛與中間神經元間的聯系，目前有動物實驗指出偏頭痛大鼠頸髓興奮性谷氨酸能中間神經元表達增強，抑制性GABA能中間神經元表達減弱[3]，LEV可使癲癇小鼠海馬區的GABA能神經元內在特性及編碼能力增強[8]，但LEV對偏頭痛大鼠中間神經元是否有影響，目前尚未見報道。本實驗研究LEV對偏頭痛大鼠高頸髓中間神經元的影響，探討其對偏頭痛防治作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只雄性清潔級SD大鼠，體重250 g～300 g，由山西醫科大學實驗動物中心提供。維持室溫22 ℃，相對濕度50%，壓強梯度30 Pa，自然光照節律，普通飲食。

1.2 藥品和試劑 兔抗GABA抗體，由北京博奧森生物技術有限公司提供；兔多克隆抗體to L Glutamate(abcam9440)、SABC試劑盒、DAB顯色劑，由博士德生物工程有限公司提供；硝酸甘油注射液(每支5 mg)由河南潤弘制藥股份有限公司生產(批準文號：國藥準字H20057216，產品批號：1604202)；LEV(0.5 g/片)由UCB Pharma S.A.(比利時)生產(批準文號：H20110410，產品批號：137713)，按照成年人每天1000 mg為低劑量，2 000 mg為高劑量，根據人和大鼠的等效劑量換算，計算大鼠LEV用藥量，用生理鹽水配成LEV溶液(低劑量為100 mg/kg，高劑量為200 mg/kg)備用；4%多聚甲醛固定液，博士德生物工程有限公司，產品批號：11K17B68；10%水合氯醛溶液：100 mL生理鹽水加入10 g水合氯醛(天津市科密歐化學試劑有限公司生產，批號：20151010)，現配現用，避光保存。

1.3 動物造模給藥 將24只健康雄性SD大鼠普通喂養1周后，采用分層隨機法，將其分成假模型組(6只)和模型組(18只)，參照文獻方法[9-10]，假模型組大鼠于頭頸背部皮下注射生理鹽水2 mL/kg，模型組大鼠于皮下注射硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg，完畢時輕柔背部，防止出現血腫塊，再將模型組大鼠隨機分為模型對照組(6只)、LEV低劑量干預組(6只)及LEV高劑量干預組(6只)。假模型組大鼠給予生理鹽水2mL/kg灌胃，1次/日，連續7 d。于末次灌胃后1 h進行皮下注射生理鹽水2 mL/kg。模型對照大鼠給予生理鹽水2 mL/k g灌胃，1次/日，連續7 d。于末次灌胃后1 h進行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。LEV低劑量干預組大鼠給予LEV 100 m g/kg灌胃，1次/日，連續7 d。于末次灌胃后1 h進行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。LEV高劑量干預組大鼠給予LEV 200 mg/kg灌胃，1次/日，連續7 d。于末次灌胃后1 h進行皮下硝酸甘油10 mg(2 mL)/kg。

1.4 大鼠行為學檢測 造模成功以后用攝像機拍攝大鼠隨后90 min的行為表現，每30 min作為一觀察時間單位，采取持續時間分段計數的方式觀察各個時間段內大鼠撓頭、爬籠和甩頭的情況并記錄次數。

1.5 大鼠灌注固定和標本準備 復制偏頭痛大鼠模型3 h后，所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行麻醉，仰臥位固定。開胸、暴露心臟，通過心尖部插管至主動脈，將250 mL生理鹽水沿左心室插管處勻速注入，當心臟膨大時剪開右心耳，可見血液流出，待流出的液體變淡，成清亮后更換為4%多聚甲醛，先快速注入50 mL，可見大鼠四肢抽搐，隨后放慢速度，共注入250 mL多聚甲醛，大鼠肝臟變為灰白。充分固定后取大鼠后正中線暴露脊柱，咬骨鉗輕輕去除棘突，用蚊式止血鉗將椎骨輕輕掰開，暴露脊髓，用蚊式鑷提起一端，用蚊式剪將兩側的脊神經剪斷，取頸髓1-2，浸入固定液中保存。對頸髓組織行石蠟切片，厚度3 μm一張，每塊組織切4張，貼于多聚賴氨酸處理過的載玻片上，60 ℃烤片2 h備用。

1.6 病理切片常規HE染色 先行常規HE染色，在顯微鏡下觀察組織結構，并進行免疫組化染色。

1.7 圖像定量分析 在同側脊髓后角隨機選取5個高倍視野，相同背景下采圖，觀察免疫陽性細胞形態，記錄陽性細胞數，取其均值進行統計學比較。

2 結 果

2.1 大鼠行為學變化 觀察大鼠各個時間段行為學指標(撓頭、爬籠、甩頭)的變化，發現假模型組大鼠起先30 min內的爬籠次數和甩頭次數明顯多于本組其他時間段，可能與皮下注射引起的應激反應有關。與假模型組比較，其余各組大鼠的撓頭次數、爬籠次數和甩頭次數于注射硝酸甘油后各時間段均呈明顯增加(P<0.05)。與模型對照組比較，LEV干預組大鼠撓頭次數、爬籠次數和甩頭次數均隨著給藥劑量的升高而降低，其中在30 min時間段，LEV低、高劑量干預組大鼠的撓頭次數、爬籠次數和甩頭次數均有明顯差異(P<0.05)；在60 min時間段，LEV低劑量干預組大鼠的撓頭次數、爬籠次數、甩頭次數及LEV高劑量干預組的大鼠撓頭次數、爬籠次數差異有統計學意義(P<0.05)，而LEV高劑量干預組的大鼠甩頭次數沒有明顯差異(P>0.05)；在90 min時間段，LEV低劑量干預組的大鼠撓頭次數、爬籠次數及LEV高劑量干預組的大鼠撓頭次數有明顯差異(P<0.05)，而LEV低劑量干預組的大鼠甩頭次數及LEV高劑量干預組的大鼠爬籠次數、甩頭次數無統計學意義(P>0.05)。詳見表1～3。

表1 各時間段大鼠撓頭次數的變化(±s) 次

表2 不同時間段大鼠爬籠次數的變化(±s) 次

表3 不同時間段大鼠甩頭次數的變化(±s) 次

2.2 大鼠頸髓中間神經元的變化 鏡下可見谷氨酸免疫反應陽性細胞，胞漿呈棕褐色，周圍著色深，胞體呈錐體形、圓形或橢圓形，有一個或多個突起，主要分布在脊髓后角。與假模型組比，其余各組的谷氨酸免疫陽性細胞表達明顯增多(P<0.05)，與模型對照組比較，LEV低、高劑量干預組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應陽性細胞表達明顯降低(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表4。γ-氨基丁酸免疫反應陽性細胞的形態學表現為黃褐色，類圓形或卵圓形，核染為主，以后角分布為著。與假模型組比較，其余各組的GABA免疫陽性細胞表達明顯減少(P<0.05)，與模型對照組比較，LEV低、高劑量干預組大鼠頸髓谷氨酸免疫反應陽性細胞表達明顯增多(P<0.05)，且呈劑量依賴性。詳見表5。

表4 大鼠頸髓谷氨酸陽性細胞數的比較(±s) 次

表5 大鼠頸髓GABA陽性細胞數的比較(±s) 次

3 討 論

目前，關于偏頭痛發生的機制更傾向于三叉神經血管學說。包括外周疼痛感受器對化學刺激產生的激活和敏化，反復持續的刺激所導致的脊髓后角神經元的超敏反應，隨后接連發生的中樞敏化及相關腦網絡異常[11-12]。中樞神經系統內存在固有的疼痛調節通路，末梢感受器將疼痛信號傳入到脊髓二級神經元、三叉神經頸髓復合體，而三叉神經頸復合體作為中樞疼痛調節通路中的重要環節，有研究顯示，反應其傳導通路的三叉神經-頸反射和瞬目反射(BR)在偏頭痛病人中出現了電生理變化，如潛伏期延長、波幅降低等改變[6]。中間神經元連接著感覺神經元和運動神經元，介導信號的傳入和傳出，有研究指出運動指令可能通過中間神經元進行傳遞[13]。在中樞神經系統，興奮性遞質以Glu為代表，抑制性神經遞質與以GABA為代表，兩者處于動態平衡，與感覺和運動協調密切相關，當這種“興奮-抑制”穩態失衡，對傷害性信息傳遞的抑制作用減弱時，會提高中樞神經的興奮性。最近的實驗結果發現，在偏頭痛大鼠模型中，大鼠頸髓1-2前角ChAT和C-Fos蛋白表達量均增多，Glu能神經元興奮性增強，GABA能神經元抑制性減弱，說明頸髓1-2前角運動神經元發生了激活現象，這一結果可能與偏頭痛病人的頸部肌肉癥狀相符合，進一步證明了中間神經元介入了偏頭痛過程，“興奮-抑制”平衡破壞，功能紊亂，成為導致感覺-運動功能異常的一種機制[3]。Grilllner[14]研究證實，在脊髓中Glu能神經元可通過互相激活，從而使整個興奮性中間神經元被激活。Li 等[15]發現，Glu的異樣轉運可對脊髓運動神經元形成選擇性的傷害。選擇性基因敲除GABA合成酶Gad2表達的中間神經元可影響肌肉活動，而增加GABA、運用GABA受體激動劑能緩解肢體痙攣癥狀[16-17]。

LEV已廣泛用于成人及兒童的癲癇部分性發作和繼發全面性發作的治療，而且對難治性部分性發作有很好的療效。近年來有大量報道指出LEV對偏頭痛的防治有良好的效果。Pizza等[18]對老年性偏頭痛病人給予LEV進行防治，結果顯示其頭痛發作的次數減少，耐受性也較好。LEV可使每月偏頭痛發作的次數明顯減少，其發作次數降低50%以上的病人百分比為64%，而安慰劑組為22%。王維等[19]發現不管單用LEV還是聯合用藥，治療12周時均可使偏頭痛的發作次數、持續時間和疼痛程度降低，不良反應較少，病人耐受性較好，且聯合用藥的效果更顯著。

有關LEV防治偏頭痛的研究大多為臨床觀察，而闡述其作用機制的卻很少。在LEV治療癲癇方面，倪紅等[8]發現LEV組干預后癲癇小鼠海馬區GABA能神經元內在特性和編碼能力增強，而目前已有動物實驗研究偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的變化[3]。

本實驗以LEV為干預藥物，通過免疫組化的方法，觀察硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的變化。結果顯示，與模型組大鼠比較，LEV低、高劑量干預組大鼠的撓頭次數、爬籠次數及甩頭次數均明顯減少，谷氨酸免疫反應陽性細胞表達明顯降低，GABA免疫反應陽性細胞表達明顯升高，提示谷氨酸和GABA在偏頭痛發作中的作用可能是通過下調脊髓興奮性Glu的釋放，減少NMDA受體和GABA受體的磷酸化，使興奮性NMDA受體功能下調，抑制性GABA能神經元的作用增強[20]。此外，PKC(與中樞敏化相關的蛋白激酶C)還可使環磷酸腺苷反應元件結合蛋白(CREB)以及激活轉錄因子-2(AFT-2)磷酸化，調節c-Fos和C-Jun的轉錄和翻譯，進一步引起脊髓中間抑制性神經元的凋亡[21]。因此，在偏頭痛傷害性信息傳遞過程中，內源性抑制作用被阻斷，而脊髓神經元的興奮性升高。

綜上所述，對于硝酸甘油所誘導的偏頭痛大鼠模型，其高頸髓部位的谷氨酸能和GABA能中間神經元之間的穩態失衡，興奮功能上調，抑制作用下降，這可能為偏頭痛中樞機制提供了理論擴充，而LEV可能是通過調節頸髓中間神經元“興奮-抑制”穩態的平衡來改善偏頭痛大鼠頭痛癥狀的。本實驗仍需要補充頸髓前角運動神經元的變化及實驗對象的電生理檢查，進一步研究LEV對中間神經元影響的具體機制。

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(本文編輯王雅潔)

國家臨床重點專科建設項目(No.2013-544)

1.山西醫科大學(太原030001)；2.山西醫科大學第一醫院

牛爭平，E-mail:nzp105@sina.com

信息：吳建坤，牛爭平.左乙拉西坦對硝酸甘油致偏頭痛大鼠高頸髓谷氨酸能和GABA能中間神經元的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15(12)：1456-1460.

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.12.010

1672-1349(2017)12-1456-05

2017-05-06)