音樂電針對急性腦出血大鼠灶周鐵離子、神經元細胞凋亡百分率和腦組織含水量的影響

徐春蘭,王凡,東紅升

(1.上海中醫藥大學,上海201203;2.上海市針灸經絡研究所,上海 200030)

音樂電針對急性腦出血大鼠灶周鐵離子、神經元細胞凋亡百分率和腦組織含水量的影響

徐春蘭1,王凡1,東紅升2

(1.上海中醫藥大學,上海201203;2.上海市針灸經絡研究所,上海 200030)

目的觀察音樂電針對急性腦出血大鼠腦內灶周鐵離子變化、神經元細胞凋亡和腦組織含水量變化的影響,探討音樂電針對急性腦出血的作用機制。方法將128只健康成年雄性Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、電針組和音樂電針組,每組分為6h、24h、3d、7d 4個時間點,每個時間點8只。應用膠原酶法制備急性腦出血大鼠模型。電針組和音樂電針組正極接百會穴,負極接太陽穴,選擇參數為2 V,通電時間為30min。于造模后6h、24h、3d、7d 4個時間點觀測腦內灶周鐵離子變化的水平、灶周神經元細胞凋亡及腦組織含水量的變化。結果造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂電針組大鼠腦內鐵離子含量、神經元細胞凋亡均高于正常組(P＜0.05),24h、3d、7d時電針組、音樂電針組均低于模型組(P＜0.05),3d、7d時音樂電針組低于電針組(P＜0.05)。造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂電針組大鼠腦組織含水量均高于正常組(P＜0.05),3d時電針組、音樂電針組均低于模型組(P＜0.05),7d時音樂電針組低于電針組(P＜0.05)。結論音樂電針對急性腦出血大鼠腦內灶周鐵離子有良性調節作用,抑制腦出血后早期血腫周圍部位神經元細胞凋亡的發生,減輕腦水腫,療效優于電針組。

電針;腦出血;鐵離子;神經元細胞;大鼠

腦出血是常見的腦血管疾病,占卒中的20%～30%,具有高發病率、高致殘率的特點,給家庭和社會帶來重大負擔。近年研究發現,腦出血后紅細胞裂解,釋放的血紅蛋白及其降解產物鐵離子,在介導腦出血后氧化損傷和細胞凋亡在繼發性腦損傷機制中起著重要的作用[1]。本研究以腦出血大鼠為模型,探討音樂電針對急性腦出血大鼠腦內灶周鐵離子、神經元細胞影響,具體方法如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

128只健康成年雄性Wistar大鼠,體重為250～300g,清潔級。由上海中國科技院實驗動物有限公司提供(合格證號SCXK滬2007-0002)。飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽醫院實驗動物中心普通飼養室,人工光照,光暗各12h,45%左右相對濕度,自由飲食,飼料由上海必凱公司提供,適應性飼養1星期。大鼠隨機分成正常組、模型組、電針組、音樂電針組,每組分為6h、24h、3d、7d 4個時間點,每個時間點8只。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

膠原酶Ⅶ(Sigma America);肝素(江蘇江山生化制藥有限公司);水合氯醛(中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司)。

1.2.2 主要儀器

動物頭顱立體定位儀(深圳瑞沃德生命科技有限公司,單臂腦立體定位儀/8001);微量進樣器(上海高欣玻璃儀器);牙科鉆頭(北京醫療設備廠);IMS細胞圖像分析系統醫學圖像分析軟件(上海申騰信息技術有限公司);顯微鏡(OLYMPUS BH2);數碼相機(NI KON儀器);切片機(RM2145,Lico,德國);凝膠成像分析系統(Chemi Imager5500,Alpha Innotech,美國);組織勻漿機(UP 200s,DR Hielscher,德國);恒溫水浴箱(1070,FEL,德國);LSRⅡ型流式細胞儀(BD公司);華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠);音樂電針儀2J-12H(哈爾濱福恩堂醫療器械有限公司)。

1.3 造模方法

參照任澤光等[2]的方法,大鼠10%水合氯醛(400 mg/kg)腹腔麻醉后,俯臥位固定于腦立體定位儀,調節門齒托的高度,使動物的前、后齒處于同一水平。頭頂備皮后,局部皮膚采用碘伏消毒,在頭頂部約前囟所在位置縱向剪一長10mm的窗口,剝離骨膜,以前囟為坐標原點,向前0.48mm,向右 3mm,確定注射點坐標,用牙科鉆鉆直徑約1.0mm圓孔直達骨膜,穿透顱骨但不傷及腦組織(按Pellegrio圖譜B坐標系定位右尾核,A 0.48～0.5;R 2.6～3.4;H 5.0～7.0)。用微量注射器吸取含0.25u/μL膠原酶的生理鹽水和6.25u/μL肝素的生理鹽水各10μL,沿鉆孔處豎直、緩慢進針6.0mm,緩慢勻速注射5min后,留針10min,緩慢退針2～3min,切口處撒少許青霉素粉防止局部感染,縫合皮膚,放回籠內觀察、飼養。造模后的動物在自然蘇醒后,參照Zea-Longa的5級評分標準[3],對其神經障礙進行評分。0級,無神經功能喪失;1級,右前肢不能充分伸展;2級,向右環形運動,輕度局灶神經功能缺失;3級,向右側倒,中度局灶神經功能缺失;4級,不能自然行走,重度局灶神經功能缺失。只有神經功能障礙在1級(含)以上的存活大鼠才能入組。

1.4 治療方法

參照《實驗針灸學》[4],大鼠百會穴定位于大鼠頭頂兩耳根連線與前后中線交點。太陽定位于外眼角與耳之間的凹陷中。常規消毒,以0.25mm× 25mm毫針,分別刺入百會(向右前太陽穴方向)和太陽(右側)穴。電針組將正極接百會穴毫針,負極接太陽穴毫針,選擇參數為2 V、15 Hz,連續波,通電時間為30min。音樂電針組將2J-12H型音樂脈沖治療儀正極接百會穴,負極接太陽穴,選擇參數為2V,選中風治療單元樂曲聲波,通電時間為30min。6h組為造模后6h針刺1次后取材檢測,24h為造模后24h針刺1次后取材檢測,3d、7d為造模后每日針刺1次。

1.5 樣本取材處理

治療結束后,頸椎脫臼方法處死大鼠。然后用剪刀迅速沿著枕骨大孔處剪斷頸椎,用止血鉗迅速剝離顱骨,將大腦取出,取注射部位腦組織后部,平均分為兩份,放置在凍存管中,低溫保存。用于鐵離子含量測定和流式陽性細胞百分率測定。

1.6 觀察指標

1.6.1 鐵離子含量測定

取腦組織加入濃硝酸5mL(16mol/L)和高氯酸0.5mL(12mol/L),加熱消化至清亮,用原子吸收光譜法測定。

1.6.2 流式陽性細胞百分率測定

AnnexinV檢測(磷脂酞絲氨酸外翻分析)。組織加入PBS勻漿,離心收集(1500r/min,5min)細胞;PBS洗兩遍;重懸于200μL Binding Buffer(結合液)中使細胞終濃度為2×105～1×105個/mL;加熒光標記的AnnexinV-FITC10μL和5μL PI混勻,加入300μL Binding Buffer;流式細胞儀檢測觀測結果。采用488nm激發,其檢測波長分別是527nm和590nm。

1.6.3 腦組織含水量測定

大鼠麻醉下,斷頭處死,處死后迅速提取腦作冠狀全腦切片(定位切片發現注射部位在右側尾狀核),取含注射部位腦組織前部做腦含水量測定。立即用薄層刀片取血腫周圍組織,稱濕重后將腦組織塊放入干燥箱中100℃烘烤24h后,再稱干重。按干濕重法測定腦水含量,以腦水含量代表腦水腫的程度。

計算公式為腦組織水含量=[(濕重－干重)/濕重]×100%。

1.7 統計學方法

所有數據用SPSS18.0統計軟件進行統計學分析,計量資料以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用q檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腦內灶周鐵離子比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂電針組與正常組大鼠腦內灶周鐵離子比較,差異有統計學意義(P＜0.05);電針組、音樂電針組與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。在造模后24h、3d、7d,電針組、音樂電針組大鼠腦內灶周鐵離子含量均低于模型組,差異有統計學意義(P＜0.05)。造模后 3d、7d,音樂電針組大鼠腦內灶周鐵離子含量低于電針組,差異有統計學意義(P＜0.05)。說明針刺能降低腦出血大鼠腦內灶周鐵離子含量,減輕水腫。詳見表1。

表1 各組大鼠腦內灶周鐵離子比較 (±s,mg/kg)

表1 各組大鼠腦內灶周鐵離子比較 (±s,mg/kg)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

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2.2 不同時間點各組大鼠腦組織形態學觀察

造模后在各個時間點模型組較正常組可見大量白細胞浸潤,有膠質細胞聚集現象,而電針組、音樂電針組白細胞及膠質細胞聚集較模型組少,音樂電針組較電針組更少。詳見圖1。

圖1 不同時間點各組急性腦出血大鼠TUNEL染色圖片(×200)

2.3 各組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂電針組與正常組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率比較,差異有統計學意義(P＜0.05);6h時電針組、音樂電針組與模型組比較無顯著性差異(P＞0.05)。24h、3d時電針組、音樂電針組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率與模型組比較,均低于模型組,有統計學差異(P＜0.05),電針組與音樂電針組比較無統計學差異(P＞0.05);7d時電針組、音樂電針組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率與模型組比較,均低于模型組,有統計學差異(P＜0.05),音樂電針組低于電針組,比較有統計學差異(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率比較 (±s,%)

表2 各組大鼠腦內神經元細胞凋亡百分率比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

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2.4 各組大鼠腦組織含水量比較

造模后6h、24h、3d、7d,模型組、電針組、音樂電針組大鼠腦組織含水量與正常組比較有統計學差異(P＜0.05);電針組、音樂電針組與模型組比較無統計學差異(P＞0.05)。3d時電針組、音樂電針組大鼠腦組織含水量與模型組比較,均低于模型組,有統計學差異(P＜0.05),電針組與音樂電針組比較無統計學差異(P＞0.05);7d時電針組、音樂電針組大鼠腦組織含水量與模型組比較,均低于模型組,有統計學差異(P＜0.05),音樂電針組低于電針組,比較有統計學差異(P＜0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠腦組織含水量比較 (±s,%)

表3 各組大鼠腦組織含水量比較 (±s,%)

注:與正常組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05;與電針組比較3)P＜0.05

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3 討論

腦出血后,血腫中心被血腫本身占位性損害,局部腦組織血液循環障礙,造成缺血缺氧。而隨著出血時間延長,出血增多,可能造成神經元生存環境的破壞,血中神經毒性物質加劇了神經元的損傷。有研究發現,腦血腫中具有很高神經毒性作用的血紅蛋白,導致脂質過氧化作用反應及自由基的形成[5]。在大鼠腦出血后,腦脊液內的自由鐵濃度增加,至少 28d后過多的鐵才能被清除[6］。神經元凋亡的重要觸發因素之一可能是血腫吸收過程中釋放的血紅素和鐵離子[7]。在腦出血過程中鐵總濃度的增加,會導致神經元細胞嚴重的毒性損傷。腦水腫是腦出血較早被發現的繼發性神經損傷之一,腦水腫的程度及持續時間與腦出血的預后密切相關。大鼠腦出血后腦內直接注射鐵離子可以直接引起腦水腫而鐵離子螯合劑能減輕水腫,說明鐵離子在腦出血水腫的形成中具有重要的作用[8]。鐵離子螯合劑可以通過降低血紅蛋白誘導的組織型轉谷氨酰胺酶的表達,減少腦出血后腦細胞發生神經退行性變[9]。

本研究結果顯示,腦出血后,針刺可降低腦內鐵離子含量,降低腦組織水腫,減少腦神經元細胞的凋亡,電針組、音樂電針組腦內鐵離子含量、腦內凋亡細胞百分率及腦組織含水量均顯著低于模型組(P＜0.05),說明腦出血后早期鐵離子濃度升高導致血腫周圍部位細胞凋亡發生,而電針能下調鐵離子含量,減輕腦水腫,減少神經元細胞凋亡。

本研究結果也表明,腦出血后,音樂電針組腦內鐵離子含量、腦內含水量及腦內凋亡細胞百分率在7d均顯著低于電針組(P＜0.05),說明音樂電針療效優于普通電針。中國古代將聲音分為角、徵、宮、商、羽五個音階,以此為基礎,音樂的調式分為五種,不同調式的音樂具有不同的感染力,產生不同的音樂效果。音樂電針療法是將音樂療法、音樂電流和電針療法結合起來治療疾病的方法[10],使患者在機體和心理上獲得雙重的治療效果[11]?！饵S帝內經》提出五音療疾的方法根據五種調式與五臟、五志的關系選曲編排治療[12]。據中國傳統五音療法理論,探索不同音樂元素、音樂電流與臟腑、經絡、器官相關的現代理論依據,從而擴展音樂范圍和臨床應用范圍,為患者提供更加有效的治療方法[13]。音樂電針結合音樂與針刺療法,其將特定的音頻信號同步轉化為頻率多變的脈沖電流,克服了傳統電針長時間單一頻率刺激所致的腧穴耐受性及不敏感性的現象[14-17]。音樂電針還能維持神經纖維的興奮性,易產生持久針感,以最大程度維持治療效果,減少治療周期[18-21]。

綜上所述,電針組和音樂電針組對急性腦出血大鼠腦內鐵離子有調節作用,改善腦內微環境的變化,減輕腦水腫,阻止神經元細胞凋亡的影響[22-25],本研究也表明,音樂電針療效優于普通電針,原因可能是音樂電針克服了長時間刺激后引起腧穴耐受性和不敏感性[26-29]。

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Effect of Music Electroacupuncture on Perifocal Ferric Ions and Neuronal Apoptosis Percentage and the Brain Water Content in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage

XU C hun-lan1, WANG F an1, DONG Ho ng-sheng2.1.Shanghai University of T raditional Ch inese Med icine,Shanghai 201203,China;2.Shanghai Resea rch Institute of Acupuncture and Meridian,Shanghai 200030,China

ObjectiveTo investigate the effect of music electroacupuncture on perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content in rats with acute cerebral hemorrhage and explore the mechanism of its action on acute cerebral hemorrhage.MethodsOne hundred and twenty-eight healthy adult male Wister rats were randomized to normal, model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups. In each group, four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days were set up, eight rats each time point. A rat model of acute cerebral hemorrhage was made using collagenase. In the electroacupuncture and music electroacupuncture groups, point Baihui was connected to the anode and point Taiyang to the cathode,2 voltage was used as a selection parameter and electroacupuncture lasted 30min. Intracerebral perifocal ferric ions and neuronal apoptosis and the brain water content were measured at four time points of 6 hrs,24 hrs,3 days and 7 days after model making.ResultsIntracerebral ferric ion content was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrsafter model making (P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 24 hrs,3 and 7 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 3 and 7 days after model making (P＜0.05). Intracerebral neuronal apoptosis was higher in the model, electroacupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 hrs after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05). The brain water content was higher in the model, electrocupuncture and music electroacupuncture groups of rats than in the normal group at 6 and 24 hrs after model making(P＜0.05), lower in the electroacupuncture and music electroacupuncture groups than in the model group at 3 days after model making (P＜0.05) and lower in the music electroacupuncture group than in the electroacupuncture group at 7 days after model making (P＜0.05).Conclusions Music electroacupuncture has a benign regulating effect on intracerebral perifocal ferric ions, inhibits neuronal apoptosis around hematoma in the early stage and reduces cerebral edema in rats with acute cerebral hemorrhage. Its therapeutic effect is superior to that of electroacupuncture.

Music electroacupuncture; Cerebral hemorrhage; Ferric ion; Neuron; Rat

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.07.0840

1005-0957(2017)07-0840-06

2016-10-21

國家自然科學基金項目(30500677)

徐春蘭(1989—),女,2013級碩士生,Email:xuchunlan23@126.com

東紅升(1971—),男,副研究員,博士,Email:dhsdoctor2005@126.com