葛根素對過氧化氫致成骨細胞氧化損傷的影響

王昌 湯旭磊 陳克明 張莉 劉偉寧 趙瑾

1.西安交通大學醫學院附屬廣仁醫院/西安市第四醫院，陜西 西安 710004 2.蘭州大學第一醫院內分泌科，甘肅 蘭州 730000 3.蘭州軍區蘭州總醫院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050 4.西安市灞橋區中醫醫院，陜西 西安 710038

隨著人口老齡化日趨明顯和人們對生活質量要求的提高，骨質疏松及其并發癥已成為全世界關注的一大社會保健和公共衛生問題，號稱“世紀慢性隱形疾病”，受到各國醫學界和國際社會的普遍重視[1]。尤其是婦女絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發病率高，危害性大，雌激素缺乏是其主要病因，但由此產生的氧化應激是參與其發病過程的一個重要環節[2-3]。雌激素替代療法因出現諸多嚴重副作用而使其應用受限。因此，尋找更有效的治療措施具有重要意義。有研究報道，葛根素(puerarin，Pue)作為一種植物雌激素具有減少骨吸收，促進骨形成，增加骨密度的作用，而在刺激子宮組織增生不良反應方面又遠較雌激素為輕[4]，還可能清除自由基和發揮抗氧化作用[5]。筆者在之前的實驗研究中發現葛根素對成骨細胞(osteoblast，OB)增殖、分化、礦化作用的影響存在劑量依賴性，并且具有雙向性[6]。本實驗旨在觀察Pue在體外對OB的影響及對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導OB氧化損傷的保護作用，為其防治骨質疏松癥提供一定的實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑

出生24 h以內的新生Wistar大鼠，SPF級，購自蘭州大學醫學院GLP實驗室；Pue購于中國藥品生物制品檢定所；MEM培養基、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自Gibco公司；胎牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、mMDA、SOD、T-AOC測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CO2細胞培養箱(Thermo Revco公司，美國)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；細胞培養板、培養皿購自美國Corning Costar公司。

1.2 細胞的分離與培養

采用0.25%胰蛋白酶和0.1%的Ⅱ型膠原酶多次消化法，由出生24 h以內的新生Wistar大鼠頭蓋骨分離成骨細胞，使用含10%胎牛血清的MEM培養液37 ℃，5%CO2培養，根據細胞形態、ALP和1型膠原染色、茜素紅S(Alizarin Red S，ARS)法和Von kossa改良法進行礦化結節染色等[7-8]方法對分離得到的成骨細胞加以鑒定。細胞在80%～90%匯合時換用含分化(礦化)誘導液的MEM培養，選用第2代細胞實驗。

1.3 細胞分組處理及氧化應激細胞模型的建立

將第2代OB分為：①正常對照組、Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)組[P組]；②正常對照組、H2O2(3×10-5mol/L～3×10-4mol/L)組[H組]；③正常對照組、1×10-4mol/L H2O2組[H′組]、“Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)+1×10-4mol/L H2O2”組[“P+H′”組]和“1×10-4mol/L H2O2+Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)”組[“H′+P”組]；④正常對照組、H′組、“10-5mol/L Pue+H′”組[“P′+H′”組]和10-5mol/L Pue組[P′組]。正常對照組和H′組使用普通MEM培養液進行培養，而P組、“P+H′”組、“H′+P”組和P′組分別用含有10-10mol/L～10-3mol/L、10-5mol/L的葛根素培養液培養。在細胞貼壁24 h或48 h(增殖期)，匯合并誘導分化24 h或48 h(分化期)后除正常對照組外，結合自己的實驗結果均用1×10-4mol/L (0.1 mmol/L)的H2O2進行處理24 h，造成細胞氧化應激損害。

1.4 細胞增殖率和ALP活性的測定

傳第2代細胞按(0.5～2.0)×104/mL接種于96孔培養板，100 μL/孔，培養24 h后，棄去培養液，按組施加不同處理因素，每組8孔。用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測定OB在Pue或和H2O2處理后第3天的增殖情況，檢測波長為570 nm；細胞匯合后誘導分化培養并用葛根素或和H2O2處理后，分別在第4天用ALP測定試劑盒用酶標儀于405 nm波長處檢測吸光度值。

1.5 細胞mMDA含量、SOD活性及T-AOC的測定

硫代巴比妥酸法測定細胞的微量MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，絡合物比色法測T-AOC，考馬斯亮蘭G250測定蛋白質水平校正各測定值。均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統計學處理

2 結果

2.1 原代細胞分離純化、培養與鑒定

多次酶消化法分離得到較高純度的原代成骨細胞，根據細胞增殖、分化及礦化過程中的形態(圖1)，成骨細胞的ALP染色、1型膠原染色和礦化結節染色等鑒定(圖2)。

2.2 不同濃度葛根素對大鼠成骨細胞增殖、分化及礦化作用的影響

與正常對照組比較，Pue 10-9mol/L～10-5mol/L均能刺激OB增殖(P<0.01)，第3天刺激最為明顯(預實驗)；細胞融合后誘導分化經Pue處理后第4天時，各濃度組與對照組比較ALP活性OD值的差異具有統計學意義(P<0.01)，即除10-3mol/L組外其余有較明顯促進細胞分化的作用；對照組礦化結節形成較少，Pue 10-8mol/L～10-5mol/L形成礦化結節數高于對照組(P<0.05)。組間兩兩比較，10-6mol/L組OD值明顯高于其他各組(P<0.01)，而10-6mol/L組形成的礦化結節數增高也最明顯(P<0.01)，結果見表1。

2.3 不同濃度H2O2對成骨細胞增殖與分化的影響

2.3.1H2O2的細胞毒性反應：加入H2O2>1×10-4mol/L(0.1 mmol/L)時產生細胞毒性反應，在

鏡下見貼壁細胞幾乎全部從培養皿底部脫落，培養液上漂浮一層死細胞(圖3)。

2.3.2不同濃度H2O2對成骨細胞生長的影響：在H2O2濃度低于7×10-5mol/L時，各檢測值較對照組均有顯著增加(P<0.001)；而H2O2濃度達9×10-5mol/L以上時，反映細胞增殖和分化的OD值均有明顯下降(P<0.001)，見表2。

表1 不同濃度葛根素對成骨細胞增殖(MTT值)、分化(ALP活性)和礦化(礦化結節形成數)的影響Table 1 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation, alkaline phosphatase activity, and the formation of mineralized nodules of osteoblasts

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與10-6mol/L組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01(因統計已顯示：不同濃度Pue組間兩兩比較，10-6mol/L組較其他濃度組差異顯著且OD值也最高，故為方便顯示表中僅以該濃度組為陽性對照組做比較)。

Note: Compared with the normal/control group,★P<0.05，★★P<0.01；Compared with the 10-6mol/L group,▲P<0.05，▲▲P<0.01 (The statistics have showed that the 10-6mol/L group was more significant difference than the other concentration of Pue groups and its OD value was the highest, so we only took 10-6mol/L group as positive control group for the convenience to show in the table).

表2 H2O2對成骨細胞增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影響Table 2 The effect of different concentrations of H2O2 on proliferation and alkaline phosphatase activity of osteoblasts

注：與對照組相比，★P<0.01，★★P<0.001。

Note: Compared with the control group,★P<0.01，★★P<0.001.

圖3 A和B顯示H2O2濃度分別為0.5 mmol/L和1 mmol/L時的細胞狀態。從形態上看，培養細胞首先出現突出收縮、變得細小，似干枯的樹枝(A)；胞體萎縮甚至崩解成碎片，隨后脫壁漂浮于培養基中(B)(100×)Fig.3 A and B were H2O2 concentrations of 5×10-4 mmol/L and 1 mmol/L, respectively. In morphology, cells appeared shrinkage and small, and dry branch like (A); the cells were increasingly atrophy and even collapse into pieces, then dropped and floated in the culture medium (B, 100×).

2.3.3適當濃度H2O2處理成骨細胞前后的形態學變化：見圖4、5。

圖4 用H2O2處理OB前的細胞狀態(100×)。加入H2O2之前，細胞生長旺盛，邊界不清(A為培養第4天，B為培養第6天)Fig.4 Morphological characteristics of osteoblasts prior to the addition of H2O2 (100×). The cells grow vigorously and its boundary were obscure before adding H2O2. (A, 4 days after culture; B, 6 days after culture).

圖5 用H2O2處理OB后的細胞狀態(100×)。加入含H2O2的培養液后，細胞伸出的偽足稍有收縮，使細胞的分界明顯(A：H2O2 0.1 mmol/L)；當H2O2濃度≥0.2 mmol/L時細胞開始出現大量死亡(B：H2O2 0.2 mmol/L)Fig.5 The morphological changes of osteoblasts treated with H2O2 (100×). The cellular pseudopods appeared shrinkage and the boundary of cells was obvious after adding H2O2 (A: H2O2 0.1 mmol/L). When the concentration of H2O2≥0.2 mmol/L, a large number of cells became dead. (B: H2O2 0.2 mmol/L).

2.4 不同濃度葛根素對H2O2損傷成骨細胞的影響

2.4.10.1 mmol/L H2O2對成骨細胞生存狀態的影響：通過以上實驗數據顯示，0.1 mmol/L H2O2加入正常生長的成骨細胞，既可對OB增殖和分化產生最大抑制作用，又不會產生嚴重毒性作用而使細胞大量死亡。用AM/PI熒光染色加入0.1 mmol/L H2O2的成骨細胞并在熒光顯微鏡下觀察細胞的生存狀態(圖6)。

圖6 熒光顯微鏡下的細胞狀態，示加入H2O20.1 mmol/L，在同一視野下存活細胞顯示黃綠色熒光(A)，而死亡細胞顯示被染成紅色(B)Fig.6 Under the fluorescence microscope, when 0.1 mmol/L of H2O2 were additioned into the culture, the survival cells showed yellow-green fluorescence (A), but dead cells were dyed red (B) in the same visual field.

2.4.2不同濃度葛根素對0.1 mmol/L H2O2損傷成骨細胞的影響：對0.1 mmol/L H2O2損傷OB前或后加入不同濃度Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)所得的觀察值(MTT值和ALP活性的OD值)進行比較，組內因素效應(保護或修復損傷的效應)差異有顯著統計學意義(P<0.001，表中未標示，下同)，組內因素(保護或修復損傷)與組間因素(不同Pue濃度)間的交互效應在MTT值的比較中差異無統計學意義(P>0.05)，而在ALP活性檢測中差異有統計學意義(P<0.01)；不同組別間的觀察值差異有顯著統計學意義(P<0.001)，與正常對照組比較，各組MTT值和ALP活性顯著降低(P<0.001)。與H2O2組相比，在細胞增殖階段，Pue10-7mol/L～10-4mol/L組MTT值顯著增高(P<0.01，其中Pue10-7mol/L和10-4mol/L兩組比較，P<0.01，10-6mol/L和10-5mol/L兩組比較，P<0.001)；在細胞分化階段，10-8mol/L～10-4mol/L的ALP活性OD值均顯著升高(P<0.001)，見表3。

表3 不同濃度Pue對H2O2損傷OB增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影響Table 3 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblasts exposed to H2O2 n=8)

注：與正常對照組比較，各組差異均有極顯著統計學意義(P<0.001，表中未標示)；與H2O2組相比，★P<0.05，★★P<0.01。(P→H′:P+H′)和(H′→P:H′+P)分別表示先加P和先加H′。

Note: Compared with the control group, all of the other groups had statistical significance (P<0.001, not marked in the table); Compared with the H2O2group,★P<0.05，★★P<0.01. (P→H′: P+H′) indicate that add P first, and (H′→P: H′+P) that add H' first respectively.

不同濃度Pue組間兩兩比較，10-5mol/L組較其他各組差異更顯著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，所測OD值最高，但仍達不到正常組水平。

2.5 葛根素對成骨細胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影響

與正常對照組相比，單純Pue組(10-5mol/L)的mMDA含量顯著減少(P<0.01)，而SOD活性則顯著增強(P<0.01)，T-AOC也有所增加(P<0.05)；H2O2(0.1 mmol/L)組的mMDA含量顯著增高，而SOD活性和T-AOC顯著降低(P<0.01)，見表4。

表4 葛根素對成骨細胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影響Table 4 The effect of puerarin on mMDA, T-AOC, and SOD in osteoblasts

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與Pue組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與H2O2組相比，#P<0.05，##P<0.01。

Note: Compared with the control group,★P<0.05，★★P<0.01; Compared with the P′ group (Pue10-5mol/L),▲P<0.05，▲▲P<0.01; Compared with the H′ group (H2O20.1 mmol/L),#P<0.05，##P<0.01.

Pue使受損OB的mMDA含量顯著減少(P<0.01)，而SOD活性(P<0.01)和T-AOC則均顯著增強(P<0.05)，但仍不能使mMDA含量(P<0.01)、SOD活性(P>0.05)和T-AOC(P<0.01)恢復正常。

3 討論

成骨細胞是具有成骨潛能的細胞，也是骨組織中主要的功能細胞，它對骨組織的生長發育、損傷修復、骨代謝平衡和骨量的維持等均起著關鍵作用，它不僅分泌骨基質參與成骨，同時也參與破骨細胞(osteoclast，OC)對骨吸收功能的調節。OB數量不斷增加，即可產生更多的骨組織；反之，若OB減少或功能減退則可導致骨小梁變細、薄弱、穿孔，皮質骨出現多孔性改變等問題[9]。筆者用新生24 h內Wistar大鼠頭蓋骨經過多次酶消化法成功地獲得了生物學性能良好的OB，分離和培養的OB呈三角形、多邊形、菱形或不規則形，胞核較大呈卵圓形。

近年來，植物雌激素因其初步的療效和較小的毒副作用而具有良好的前景，成為目前研究的熱點之一。Pue是一種異黃酮類植物雌激素，化學名為4′,7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，是中藥葛根的主要成分，且我國有豐富的野生葛根資源。Pue具有雌激素樣活性，副作用也相對較少[4]。但Pue在體外影響骨代謝，尤其是設置較大濃度范圍的Pue對OB功能的影響及其對OB抗氧化損傷作用的相關研究鮮見報道。因此，此領域的研究具有一定的現實意義。鑒于在大多數國內文獻中一般只設置了3～4個Pue濃度進行相關研究，為了更全面了解藥物的作用和效能，筆者在之前的實驗[6]中觀察了Pue較大濃度范圍(10-10mol/L～10-3mol/L)，結果顯示，Pue在較低濃度下(10-8mol/L～10-5mol/L)刺激OB成骨的作用明顯，其中10-6mol/L作用最顯著(P<0.01)；在較高濃度(10-4mol/L～10-3mol/L)的促進作用不顯著，甚至會產生抑制；而過低的Pue濃度(10-10mol/L～10-9mol/L)則不會產生明顯的促進作用，即與對照組比較差異無統計學意義。換言之，適當劑量的葛根素能明顯促進成骨細胞的增殖(尤以培養第3天時增殖最快)、分化(培養并誘導分化48 h后ALP活性增強)和礦化功能，礦化結節數量顯著多于對照組(P<0.01)。

近年來的研究表明，在骨質疏松癥的發病機制中氧化應激起到了非常重要的作用[2，10]。由H2O2介導造成對細胞的損傷，取決于受損細胞的類型和施加的劑量大小[11]。本次實驗發現，成骨細胞中H2O2濃度低于7×10-5mol/L時可刺激其生長和分化；而H2O2濃度達9×10-5mol/L以上時，OB的增殖和分化均起到明顯的抑制甚至呈現細胞毒作用(P<0.001)，提示H2O2可能具有雙向性作用，即較低濃度促進OB生長和分化，而隨著濃度的增加這一效應消失甚至被抑制。通過多次實驗和反復比較，最終決定采用1×10-4mol/L的H2O2，該損傷濃度既對OB的增殖和分化產生最大的抑制作用，同時又不會對其產生嚴重的毒害而導致細胞死亡。此與郭寶磊[12]、Zhang[13]和Lee[14]等在研究中所采用的H2O2濃度基本一致，盡管各自報道造成氧化損傷的準確劑量并不完全相同，范圍從0.01 mmol/L～1 mmol/L不等。不過這種差異可能與細胞的類型、來源、狀態，藥物的配置準確性及細胞對氧化刺激物的耐受性不同等因素有關。與H′組比較，“P+H′”和“H′+P”組中的10-7mol/L～10-4mol/L Pue使受損OB的MTT值升高(P<0.01)，10-8mol/L～10-4mol/L使ALP活性增加(P<0.001)，在各濃度組中都以10-5mol/L 的Pue組影響更為顯著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，提示10-5mol/L的Pue組發揮抗氧化作用最顯著，故其保護和修復作用更為明顯(P<0.01)，且與H2O2損傷后比較，在H2O2損傷前加入Pue能起到更好的保護作用(P<0.001)，但是其OD值均低于正常對照組(P<0.001)。據此得出結論：用H2O2損傷OB后其增殖和分化程度均受到嚴重抑制，Pue對OB所受氧化損傷(或氧化應激狀態OB)有比較強的保護和修復作用，尤其是其預防保護作用顯著強于修復作用(P<0.001)，在OB的分化過程中這種作用更顯突出(P<0.001)。然而這種作用畢竟有限，仍然達不到未受損(正常對照組)的水平。目前關于Pue對氧化應激OB的影響尚未見文獻報道。不過，筆者的研究團隊以前研究大體的結果也顯示[15]，Pue可以改善OVX大鼠的氧化應激狀態，防止骨質疏松和血管病變的發生。

植物雌激素作為抗氧化劑可以阻止H2O2介導的氧化損傷。在所有植物抗氧化劑中，以黃酮類化合物研究最多，其清除自由基的作用也最強，通過酚羥基與自由基反應形成穩定半醌式自由基結構，酚羥基是其抗氧化作用的主要活性基團，而B環是清除自由基的主要活性部位。從結構上分析，Pue含有兩個酚羥基，為異黃酮類化合物，這可能是其發揮抗氧化作用和清除氧自由基功能的結構基礎[16-17]。

另外，H2O2組的成骨細胞SOD活性和T-AOC減弱，mMDA含量增加，這與細胞增殖活力和分化、礦化功能受到抑制之間的關系尚不清楚，推測OB氧化產物(如MDA)和抗氧化酶的變化與細胞功能改變之間可能是互為因果關系。相比之下，Pue對H2O2氧化損傷的OB具有明顯的保護和修復作用，說明Pue作為一種植物雌激素，除了可能發揮雌激素樣作用外，還具有抗氧化作用，可以有效地保護和預防H2O2對OB造成的氧化損傷(P<0.01)，但仍不能使細胞的抗氧化酶系統完全恢復至受損前水平。然而，在并不造成氧化應激狀態的情況下單純加入Pue，SOD活性和T-AOC明顯較正常對照組要高，MDA卻相反(P<0.05)，說明在體外正常培養OB的情況下也可能會發生弱的氧化應激反應，這進一步證實了Pue的抗氧化能力。

Dreher等[18]認為，OB自身具有一定的抗氧化能力，硒蛋白(selenoproteins)具有類谷胱甘肽過氧化物酶的作用，在人胚OB中的表達說明OB有一套新的抗氧化防御體系，它能保護OB免受骨改建過程中OC產生的H2O2的損害。但OB這種抗氧化作用畢竟有限，過多ROS的產生會導致OB的死亡，減少OB的數量。從本實驗結果可以推測，實驗中的正常對照組DNA自發性損傷較低，而H2O2組DNA氧化損傷情況嚴重。這可能是由于H2O2為DNA誘導劑，它能很容易地穿透細胞膜自由進入細胞，如不被酶解則可直接進入細胞核。在結合于DNA上的金屬離子如鐵、銅等的催化下可能轉變成具有高活性的物質，或直接由H2O2誘導的氧化反應引起細胞內DNA儲藏位點的釋放，從而造成DNA鏈的斷裂。最終H2O2不但可以造成DNA鏈的斷裂，而且抑制DNA的修復。

綜上所述，雌激素的減少或缺乏會導致氧化應激，進一步促進骨質疏松癥的發生發展。然而雌激素替代治療有諸多不可避免的副作用發生。Pue是結構類似于雌激素的異黃酮類植物雌激素，本實驗研究發現其對氧化損傷的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和礦化功能的作用。Pue可以有效地防御和降低H2O2對OB的氧化損傷，進而通過淬滅自由基保護OB頑強生長，促進其成骨過程。但是這一具有抗氧化作用的植物雌激素對氧化應激后OB影響的具體機制還有待于進一步研究。