哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程控制對糖蛋白藥物糖基化影響的研究進(jìn)展

李潛 張彩喬 侯麗媛 張衛(wèi)婷

·綜述·

哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程控制對糖蛋白藥物糖基化影響的研究進(jìn)展

李潛 張彩喬 侯麗媛 張衛(wèi)婷

在生物制藥行業(yè), 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng), 尤其是主要是用于生產(chǎn)糖蛋白藥物的中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞應(yīng)用最為廣泛。蛋白質(zhì)糖基化可以影響工業(yè)化糖蛋白藥物的活性, 因此糖基化是重組糖蛋白藥物的重要質(zhì)量屬性。糖蛋白藥物糖基化水平的穩(wěn)定性尤其需要關(guān)注, 碳水化合物結(jié)構(gòu)將會決定的分子類型。最佳的糖蛋白藥物就是擁有治療效果或者篩選出同類的糖蛋白。通過調(diào)節(jié)哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)條件, 如改變細(xì)胞株, 培養(yǎng)基成分和過程控制等影響因素。生產(chǎn)融合蛋白或者單克隆抗體的生物過程變量和糖蛋白藥物質(zhì)量有著錯綜復(fù)雜的聯(lián)系, 糖基化程度的優(yōu)化將會提高產(chǎn)品功效。本文重點(diǎn)討論在工業(yè)化生產(chǎn)中通過過程控制提升糖基化水平, 并依此了解如何控制糖蛋白藥物糖基化水平。

生物工藝；哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)；蛋白糖基化；糖蛋白藥物；蛋白質(zhì)量

蛋白糖基化對于蛋白療效及糖蛋白的生產(chǎn)至關(guān)重要。商業(yè)化生產(chǎn)糖蛋白藥物首選哺乳動物表達(dá)系統(tǒng), 因其具有天然蛋白加工機(jī)制, 包括蛋白糖基化, 這樣就與天然的蛋白十分接近, 并保證治療效果。蛋白質(zhì)糖基化的形成主要是由寡糖連接到天冬酰胺的側(cè)鏈(N-連接)或者連接到絲氨酸/蘇氨酸(O-連接)。多糖會影響糖蛋白藥物活性, 同時也會并決定該糖蛋白藥物在體內(nèi)的半衰期［1］。正是因?yàn)槠涮攸c(diǎn), 糖蛋白藥物糖型需要滿足藥品監(jiān)管部門的要求規(guī)范, 以確保其有效性和安全性。

1 蛋白糖基化控制

在細(xì)胞培養(yǎng)過程控制中會影響蛋白糖基化的變量匯總。見表1。本文重點(diǎn)對細(xì)胞系、培養(yǎng)模式、生產(chǎn)工藝、細(xì)胞培養(yǎng)基這幾方面對糖基化蛋白藥物的糖基化影響研究進(jìn)行總結(jié)。

表1 細(xì)胞培養(yǎng)過程控制中會影響蛋白糖基化的變量匯總

1.1 細(xì)胞系 在設(shè)計(jì)新的蛋白質(zhì)療法中, 了解一個細(xì)胞系可以影響糖基化水平十分關(guān)鍵。主要用于商業(yè)化生產(chǎn)糖基化治療蛋白的細(xì)胞系是CHO細(xì)胞, 還有少部分使用SP2/0, 人纖維肉瘤中國倉鼠卵巢細(xì)胞(亞系克隆)(HT-1080), 人類淋巴母細(xì)胞, 小鼠骨髓瘤(NS0)細(xì)胞。有報(bào)道表明CHO懸浮細(xì)胞表達(dá)人β-干擾素與微載體貼壁CHO細(xì)胞表達(dá)的干擾素具有相同的糖型［2］。在同樣組織分離的細(xì)胞的表達(dá)功能性酶種類也是多樣化的, 從而表達(dá)糖基化蛋白的能力也不同。CHO細(xì)胞中CHO-K1和DUKX-B11都含有未激活的α(1, 3) GalT基因同樣都有低水平的NGNA。CHO細(xì)胞生產(chǎn)糖蛋白藥物是最普遍, 其他細(xì)胞系, 如人類胚胎腎細(xì)胞(HEK), 小倉鼠腎細(xì)胞(BHK), NS0和人類視網(wǎng)膜衍生細(xì)胞(PERC 6)都是正在開發(fā)生產(chǎn)細(xì)胞株［3,4］。

1.2 培養(yǎng)模式 常見的三種細(xì)胞培養(yǎng)方式是批式, 分批補(bǔ)料培養(yǎng), 灌流培養(yǎng)。據(jù)報(bào)道不同的培養(yǎng)方式會明顯的影響糖基化類型。CHO DG44細(xì)胞系產(chǎn)生的受體蛋白分泌堿性磷酸酶的糖基化蛋白特性與未擴(kuò)增的細(xì)胞系在不同的培養(yǎng)模式下進(jìn)行比較, 比較的培養(yǎng)模式包括批式培養(yǎng), 分批補(bǔ)料培養(yǎng),半連續(xù)灌流培養(yǎng)。在擴(kuò)大化生產(chǎn)的細(xì)胞系表達(dá)的糖基化蛋白糖型中甘露聚糖較少, 同時整體的唾液酸化也較少, 但兩者的差異≤10%。在灌流培養(yǎng)模式下糖基化總體水平較分批補(bǔ)料培養(yǎng)模式下培養(yǎng)的唾液酸化有所增加。總體來說, 連續(xù)灌流培養(yǎng)模式糖基化程度較批式培養(yǎng)模式有所提高, 在與批式培養(yǎng)模式下細(xì)胞增長速度快條件, 灌流培養(yǎng)模式下細(xì)胞生長速度越慢糖基化程度越高。對于采用灌流培養(yǎng)或者批式培養(yǎng),哪種更經(jīng)濟(jì)還需要由糖基化蛋白自身的情況決定。

1.3 生產(chǎn)工藝 細(xì)胞生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程參數(shù)對CHO細(xì)胞表達(dá)的EPO-Fc糖基化蛋白的生物反應(yīng)器培養(yǎng)過程的影響顯著［5］。在pH為7.0時, 唾液酸比例最大可到13, 若pH升高或降低其比例會減小。同樣, 培養(yǎng)溫度從37℃降至30℃, 唾液酸比例也會由14%降至8%。生物反應(yīng)器培養(yǎng)pH對糖基化蛋白的影響已經(jīng)進(jìn)行了研究。雜交細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)單克隆抗體培養(yǎng)基的pH對半乳糖苷化和唾液酸化作用有影響。在表達(dá)EPO時最優(yōu)的pH范圍為6.8～7.2時, 降低培養(yǎng)基pH, EPO的酸性帶會增加［6］。

溶氧水平認(rèn)為是在哺乳細(xì)胞培養(yǎng)工藝中持續(xù)監(jiān)測的指標(biāo), 其會影響蛋白糖基化。在反應(yīng)器中氧不足會產(chǎn)生對蛋白糖基化產(chǎn)生復(fù)雜的影響。例如, 溶氧的變化對于在CHO細(xì)胞表達(dá)tPA糖基化蛋白影響較小, 但是溶氧很小的改變會對CHO產(chǎn)生促卵泡激素(FSH)糖基化作用產(chǎn)生明顯影響。

銨離子是細(xì)胞代謝廢物, 主要是因?yàn)楣劝滨０泛吞於０反x產(chǎn)生的銨離子, 其在培養(yǎng)基中積累一般會對細(xì)胞有毒性。氯化銨會導(dǎo)致胞內(nèi)pH降低, 導(dǎo)致最終糖基化發(fā)生在高爾基復(fù)合體的酸性區(qū)域, 增加細(xì)胞內(nèi)pH可能與最終唾液酸化作用的減少有關(guān)系。

降低溫度可以延長細(xì)胞活力, 從而提高所有蛋白表達(dá),原則上也可以增加糖基化。細(xì)胞活力是十分重要的因素, 因?yàn)榘馓腔缚梢栽谂囵B(yǎng)基中積累逐步將單糖從聚糖上移除。在生物反應(yīng)器中溫度的改變可以提高單位體積表達(dá)蛋白的活性, 同時可維持糖型質(zhì)量［7］。相比之下, 當(dāng)溫度降低到33℃和30℃, EPO-Fc唾液酸化作用分別減少20%和40%［8］。降低溫度到30℃, 顯示了提高產(chǎn)量和降低唾液酸化作用的相關(guān)性。目前仍然無法解釋對高生產(chǎn)能力和高表達(dá)量是否正相關(guān)。高細(xì)胞活力(低唾液酸酶活性)與高細(xì)胞產(chǎn)量相關(guān)(更短的滯留時間)可能會降低整體唾液酸化作用影響。

生物反應(yīng)器剪切力是一個非常重要的工程學(xué)變量, 可影響糖型特征。通過改變攪拌速度和剪切力, 發(fā)現(xiàn)最大的破壞性剪切力水平必須要達(dá)到tPA 天冬酰胺184位點(diǎn)最小程度的占用, 原因是剪切力減少了tPA在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的停留時間。在工藝放大或者現(xiàn)有工藝轉(zhuǎn)移過程中剪切力是需要重點(diǎn)考慮的, 監(jiān)測剪切力對蛋白糖基化不同表型的影響(例如從灌流培養(yǎng)到批式培養(yǎng)), 同樣是產(chǎn)品一致性非常重要的保證。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)基 哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)基基本上由50～100種化學(xué)限定性的物質(zhì)組成, 同時還有少數(shù)不確定物質(zhì)這些物質(zhì)有時作為補(bǔ)料。這些不確定的物質(zhì)包括蛋白胨、酵母抽提物、植物水解物和血清。已有文獻(xiàn)報(bào)道一些不確定物質(zhì)在糖基化蛋白中的影響。目前, 血清和動物來源物質(zhì)因其不確定性和安全性風(fēng)險, 不推薦在生物制藥工業(yè)中使用。

已明確的培養(yǎng)基成分如葡萄糖, 谷氨酰胺, 半乳糖都在糖基化控制中起了擔(dān)任了十分重要角色。葡萄糖限量的CHO細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)表達(dá)無糖基化的IFN-γ是可以的。CHO批式培養(yǎng)生產(chǎn)IFN-γ發(fā)現(xiàn)在低于0.1 mmol/L的谷氨酰胺和0.7 mmol/L的葡萄糖條件下, 可以降低唾液酸化作用類型和增加高甘露糖型的雜合聚糖。相比之下, 在低葡萄糖和谷氨酰胺濃度的條件下, 連續(xù)培養(yǎng)和非營養(yǎng)限制性培養(yǎng)模式下對比, BHK-21細(xì)胞表達(dá)人IgG-IL2融合蛋白時顯示出在寡糖型的不同的。半乳糖的流加可以幫助促進(jìn)形成更多半乳糖化的N-聚糖型。

通常, 培養(yǎng)基中小分子會引起細(xì)胞行為改變, 例如高特異性的表達(dá)。研究表明丁酸鈉可以提高產(chǎn)量, 同時可以降低細(xì)胞生長速度通過上調(diào)細(xì)胞凋亡作用和調(diào)節(jié)唾液酸化作用［9］。丁酸鈉在基因和蛋白表達(dá)水平方面的多效性影響, 在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中已經(jīng)報(bào)道多次［10］。

氨基酸添加量對哺乳動物生長和表達(dá)目的蛋白十分重要, 但是特定的濃度會導(dǎo)致糖基化類型的改變。添加額外的氨基酸(半胱氨酸, 異亮氨酸, 亮氨酸, 色氨酸, 纈氨酸, 天冬酰胺, 天冬氨酸和谷氨酸)這些在早期培養(yǎng)過程中會耗盡,導(dǎo)致rhEPO中低唾液酸化部分增加。

2 討論

哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)不僅已成為多種基因工程藥物的生產(chǎn)平臺, 在新基因的發(fā)現(xiàn)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能研究中亦起到了極為重要的作用。哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊, 提供復(fù)雜的N型糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能, 因而表達(dá)產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近于天然的高等生物蛋白質(zhì)分子。

本文重點(diǎn)對在細(xì)胞系、生產(chǎn)工藝、培養(yǎng)模式和培養(yǎng)基對糖蛋白藥物糖基化的影響進(jìn)行討論并總結(jié), 目的為持續(xù)生產(chǎn)出穩(wěn)定、一致的糖蛋白藥物提供理論支持。糖基化的控制更多的是基于工藝控制和細(xì)胞生理代謝控制。通過總結(jié)過去的研究結(jié)果了解細(xì)胞代謝途徑, 希望最終可以控制蛋白糖基化。未來目標(biāo)是通過前期的基礎(chǔ)研究, 將新技術(shù)、新細(xì)胞系表達(dá)蛋白的糖基化水平做到可控并獲得滿足要求的糖蛋白, 真正的達(dá)到質(zhì)量源于設(shè)計(jì)(QbD)的要求。

［1］ Elliott S, Lorenzini T, Asher S, et al.Enhancement of therapeutic protein in vivo activities through glycoengineerin.Nature Biotechnology, 2003, 21(4):414.

［2］ Spearman M, Rodriguez J, Huzel N, et al.Production and Glycosylation of Recombinant β-Interferon in Suspension and Cytopore Microcarrier Cultures of CHO Cells.Biotechnology Progress, 2005, 21(1):31.

［3］ Jones D, Kroos N, Anema R, et al.High-level expression of recombinant IgG in the human cell line per.c6.Biotechnology Progress, 2003, 19(1):163-168.

［4］ Petricciani J, Sheets R.An overview of animal cell substrates for biological products.Biologicals, 2008, 36(6):359-362.

［5］ 謝奎, 雷云, 黃鸝, 等.高通量生物反應(yīng)器Tubespin培養(yǎng)CHO細(xì)胞條件的優(yōu)化.中國生物制品學(xué)雜志, 2011, 24(6):715-719.

［6］ Yoon SK, Choi SL, Song JY, et al.Effect of culture pH on erythropoietin production by Chinese hamster ovary cells grown in suspension at 32.5 and 37.0 degrees C.Biotechnology & Bioengineering, 2005, 89(3):345.

［7］ Yoon SK, Song JY, Lee GM.Effect of low culture temperature on specific productivity, transcription level, and heterogeneity of erythropoietin in Chinese hamster ovary cells.Biotechnology & Bioengineering, 2003, 82(3):289-298.

［8］ Trummer E, Fauland K, Seidinger S, et al.Process parameter shifting: Part II.Biphasic cultivation-A tool for enhancing the volumetric productivity of batch processes using Epo-Fc expressing CHO cells.Biotechnology & Bioengineering, 2006, 94(6):1045-1052.

［9］ Rodriguez J, Spearman M, Huzel N, et al.Enhanced Production of Monomeric Interferon-β by CHO Cells through the Control of Culture Conditions.Biotechnology Progress, 2005, 21(1):22.

［10］ Yee JC, Gatti MDL, Philp RJ, et al.Genomic and proteomic exploration of CHO and hybridoma cells under sodium butyrate treatment.Biotechnology & Bioengineering, 2008, 99(5):1186-1204.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.14.112

2017-03-16］

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