不同組織來源間充質干細胞體外成骨分化能力的比較研究

趙剛 劉微微 高偉瑋 馬潔

天津市康婷生物工程有限公司，天津 300385

骨組織缺損是一種因外傷、腫瘤切除、感染等因素引起的骨質流失從而形成的較大間隙，這一問題在臨床較為常見并且較難處理[1,2]。隨著骨組織工程技術的不斷發展，這一問題得到了一定程度的解決。骨組織工程需要可降解的支架材料和合適的種子細胞。可降解支架材料研究的人員越來越多，取得的成果也十分顯著，但是種子細胞的選擇一直困擾著研究人員。早期研究人員選用骨細胞和骨基質細胞作為種子細胞，但是這種細胞取材困難，體外增殖能力較弱，不易作為真正的種子細胞[3]。隨后，研究人員將骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為種子細胞應用于骨組織工程，以此來修復骨缺損，并且取得了一定的成效，但是BMSCs的活力及細胞數量與供體年齡呈負相關，限制了其的應用[4-8]。因此，尋找一種替代BMSCs的細胞勢在必行。經研究證實分離培養脂肪間充質干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)和臍帶間充質干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSCs)的方法簡便，分離培養出的細胞在體外具有較強的增殖能力、多向分化潛能以及低免疫原性等優點[9-12]。因此，ASCs和UC-MSCs被認為是骨組織工程中非常有前景的種子細胞。有研究表明，I型膠原(COL I)是骨組織標志性代表因子，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨鈣素(OCN)是骨再生后期代表性因子，Osterix是骨再生過程調控骨基質形成的轉錄因子[13-16]。因此，本研究旨在通過對ASCs、BMSCs和UC-MSCs體外成骨能力的研究尋找優勢干細胞種類，為骨組織工程修復骨缺損提供一定的數據支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑：DMEM/Ham’sF-12、磷酸緩沖液(Hyclone公司)；胎牛血清(百靈公司)；青鏈霉素(華北制藥)；cck-8(上海同仁)；I型膠原酶、胰蛋白酶、堿性磷酸酶試劑盒、茜素紅(Sigma)；Trizol(Invitrogen公司)；real-time PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTMII、反轉錄試劑盒PrimScriptTMRT Master Mix(TakaRa公司)；CD14-PE、CD34-PE、CD44-PE、CD45-PE、CD90-PE、CD105-PE(BD公司)；Ficoll淋巴分離液(GE公司)，氯化十六烷基吡啶(上海試劑一廠)。

1.1.2組織：脂肪、骨髓和臍帶組織，取自天津市中心婦產科醫院。

1.2 方法

1.2.1細胞培養：脂肪間充質干細胞的分離培養：獲取無菌的脂肪組織，無菌條件下將脂肪組織剪碎，加入0.075%的I型膠原酶，消化90 min；1500 r/min離心5 min，棄上清和未消化的脂肪組織；磷酸緩沖液重懸沉淀，1500 r/min，離心5 min；完全培養液(DMEM/F-12+10%FBS)重懸沉淀，計數，將細胞以1×106/cm2接種至培養瓶中培養，3d后換液，去除未貼壁的細胞。

臍帶間充質干細胞的分離培養：獲取無菌的臍帶組織，無菌條件下剝離臍帶組織的外膜和臍帶組織內動、靜脈，分離出華通氏膠并剪碎至2～3 mm3，將剪碎的華通氏膠組織塊貼于培養瓶底面，2 h后向培養瓶內添加適量完全培養液，1 w之后換液。

骨髓間充質干細胞的分離培養：獲取無菌的骨髓，用磷酸緩沖液沖洗骨髓，1500 r/min離心5 min，去上清；加入與沉淀等體積的磷酸緩沖液，混合均勻；按照骨髓：Ficoll=1∶1的體積比例，將骨髓緩慢加入Ficoll液面上，2000 r/min離心20 min；吸取間白膜層單核細胞，加入磷酸緩沖液沖洗，1500 r/min離心5 min，棄上清；用完全培養液重懸沉淀，計數，以1×106/cm2的細胞密度接種至培養瓶中進行培養。

上述3種細胞于37℃，5%CO2的培養箱中培養。

1.2.2細胞增殖能力測定：取P3代上述3種MSCs，并以2×103個/孔接種至96孔板，采用CCK8法連續8d測定其吸光值。

1.2.3細胞表型鑒定：取P3代MSCs，待細胞長至80%～90%時，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA室溫消化2 min，1500 r/min，離心5 min；收集沉淀，磷酸緩沖液重懸細胞，過40 μm濾網，制成單細胞懸液，計數，加入FBS進行封閉；棄去FBS，用磷酸緩沖液清洗3次；將細胞制成1×108/L的細胞懸液，取100μL分別加入相應量的PE標記鼠抗人抗體CD14、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105，避光40 min，離心，磷酸緩沖液清洗1次；上流式細胞儀進行檢測分析。

1.2.4細胞成骨誘導后染色鑒定：取P3代MSC以一定密度接種至6孔板中，次日實驗組更換為成骨誘導液(10 mmol/Lβ-甘油磷酸、10-7mol/L地塞米松、50 μg/mL抗壞血酸)，對照組更換為H-DMEM+10%FBS，3 d更換1次成骨誘導液，成骨誘導9d后做堿性磷酸酶染色；3種MSCs成骨誘導后茜素紅染色鑒定：茜素紅染色后定量分析時，使用氯化十六烷基吡啶溶解鈣結節，570 nm處測OD值。

1.2.5細胞成骨誘導后分子水平鑒定：采用Trizol法提取3種MSCs成骨誘導9 d和18 d后細胞RNA，按照反轉錄試劑盒合成cDNA，然后進行RT-qPCR。引物設計：按照NCBI GenBank的人COL1、ALP、Osterix、OCN和GAPDH的mRNA序列，排除與人其他基因的同源性后設計、合成引物。

表1 3種骨再生相關基因PCR引物Table 1 The PCR primers of osteogenesis-related genes

RT-qPCR反應條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s；55退火30 s；72延伸45 s；39個循環。

1.3 統計學處理

圖2 3種MSCs增殖曲線Fig.2 The growth curve of the three MSCs cells

圖3 3種MSCs的流式檢測A:ASC0s，B:BMSCs，C:UC-MSCsFig.3 The flow cytometry analysis of the three MSCs

2 結果

2.1 細胞培養

P3代三種MSCs倒置顯微鏡下觀察到的細胞形態，細胞均呈長梭狀，集落式旋渦式生長。

圖1 3種MSCs倒置顯微鏡下觀察到的細胞形態(100×)Fig.1 The cell morphology of the three MSCs under phase contract microscope (100×)

2.2 細胞增殖能力比較

3種P3代MSC傳代后1～3 d處于潛伏期，此時細胞沒有明顯的增殖；3～5 d進入對數生長期，此時細胞增殖活躍；5 d之后細胞進入平臺期，細胞增殖趨于平緩。

2.3 細胞表型的鑒定

P3代ASCs、BMSCs和UC-MSCs流式鑒定結果，CD14、CD34和CD45表達率均低于1%，CD44、CD90和CD105的表達率均高于97%。

圖4 三種MSCs成骨誘導9dALP染色(100×)Fig.4 ALP staining of the three MSCs cells (100×)

圖5 3種MSCs成骨誘導18 d茜素紅染色(100×)Fig.5 Alizarin red staining of the three MSCs cells (100×)

2.4 細胞成骨誘導后染色鑒定MSCs成骨誘導9 d后染色

2.4.1ALP染色：P3代3種MSCs成骨誘導9d后堿性磷酸酶(ALP)染色，實驗組細胞內均有大量成骨分化蛋白ALP表達。

2.4.2茜素紅染色：P3代3種MSCs成骨誘導18 d后茜素紅染色可以看到實驗組有大量礦化鈣結節產生(如圖5)，BMSCs成骨誘導所形成的礦化鈣結節與UC-MSCs無顯著性差異，但顯著性高于ASCs(如圖6)。

2.5 細胞成骨誘導后分子水平比較

2.5.1細胞成骨誘導9 d：P3代3種MSCs成骨誘導9 d后，實驗組COLI、ALP和Osterix 3種基因均高表達(如圖7)；3種MSCs成骨誘導9 d后，UC-MSC實驗組的COLI基因表達顯著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs實驗組的ALP基因表達顯著性低于BMSCs，ASCs實驗組的Osterix基因表達顯著性低于BMSCs，UC-MSCs實驗組的Osterix基因表達與BMSCs無顯著性差異(如圖8)。

2.5.2細胞成骨誘導18 d：P3代3種MSCs成骨誘導18d后，實驗組COLI、OCN和Osterix 3種基因均顯著性高表達(如圖9)；ASCs和UC-MSCs實驗組的COLI基因表達顯著性高于BMSCs，ASCs和UC-MSCs實驗組的OCN基因表達顯著性低于BMSCs，ASCs實驗組的Osterix基因表達與BMSCs無顯著性差異，UC-MSCs實驗組的Osterix基因表達顯著性低于BMSCs(如圖10)。

圖6 3種MSCs礦化能力的定量分析Fig.6 Quantitative analysis of the mineralization ability in three MSCs*P<0.05 compared with BMSCs group

圖7 3種MSCs成骨誘導9d后COLI、ALP和Osterix基因表達Fig.7 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 9 days**P<0.01compared with control group

圖8 比較3種MSCs成骨誘導9d后COLI、ALP和Osterix基因的表達(P<0.05)Fig.8 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 9 days*P<0.05 compared with BMSCs

3 討論

自體BMSCs作為骨組織工程治療骨缺損的金種子細胞，但是自體BMSCs存在著取材難、易對患者帶來二次傷害等不足之處[8,9]。本研究希望通過對不同來源MSCs體外成骨能力的比較，找到一種優勢干細胞作為骨組織工程的種子細胞。

本研究通過體外實驗，發現3種MSCs細胞均呈長梭型，且細胞呈漩渦式生長；3種MSCs的P3代細胞在3～5 d處于對數生長期，說明3種MSCs在體外增殖方面無顯著性差異。通過流式細胞儀檢測3種MSCs表面標志物，發現3種MSCs細胞表面均表達CD44、CD90和CD105且表達率均高于97%，說明ASCs和UC-MSCs與BMSCs在細胞表面標志物表達方面無顯著性差異，均屬于MSCs范疇。進一步通過體外染色實驗發現3種MSCs成骨誘導后，實驗組細胞內均表達成骨分化蛋白ALP和礦化蛋白。茜素紅染色后定量分析發現UC-MSCs和BMSCs在鈣結節形成方面無顯著性差異。

圖9 3種MSCs成骨誘導18 d后COLI、OCN和Osterix基因表達Fig.9 The gene expressions of Osterix, ALP, and COL1 in three MSCs induced after 18 days**P<0.01compared with control group

圖10 比較3種MSCs成骨誘導18 d后COLI、OCN和Osterix基因的表達Fig.10 Comparison of the gene expressions of COLI, ALP, and Osterix among the three MSCs induced after 18 days*P<0.05 compared with BMSCs

經研究證實骨再生過程經歷了早期和后期兩個階段，ALP是骨再生早期的代表性因子，骨鈣素(OCN)是骨再生后期的代表性因子，COL1是骨組織再生過程以及骨組織的代表性因子，Osterix基因是在骨再生過程中調控骨基質的形成[17-21]。本研究采用實時熒光定量PCR法比較3種MSCs經成骨誘導后Osterix、ALP、OCN和COLI基因的表達，比較結果發現3種MSCs實驗組的四種與骨再生相關的基因均顯著性高表達于對照組。而ASCs和UC-MSCs實驗組的ALP和OCN基因的表達顯著性低于BMSCs組；但是比較COLI基因的表達，發現ASCs和UC-MSCs較BMSCs顯著性高表達；比較Osterix基因的表達，發現成骨誘導9d時，ASCs的Osterix基因較BMSCs顯著性低表達，但是成骨誘導18d時，ASCs實驗組的Osterix基因較BMSCs顯著性高表達；由此說明3種MSCs經成骨誘導后，其成骨再生相關基因表達的時序性存在著一定的差異。由此得出ASCs和UC-MSCs經過成骨誘導后，決定成骨再生相關因子的基因與BMSCs誘導組基因表達趨勢相一致，進一步說明ASCs和UC-MSCs可替代BMSCs作為骨組織工程的種子細胞來治療骨缺損。

本研究將為骨組織工程選擇種子細胞提供新的思路，為臨床上應用骨組織工程治療骨缺損提供可靠的數據支持，為骨組織工程更好的治療骨缺損提供幫助。