電針對(duì)去卵巢大鼠骨形成及骨吸收活性的影響

浪萬英 王亞軍 宋亞文 張來舉 宋凱

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

目前，骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病率逐年上升，且以其嚴(yán)重的臨床癥狀引起醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[1-3]。醫(yī)學(xué)界專業(yè)研究人員致力于探索有效的治療方法來攻克這一臨床難題，主要通過探索西醫(yī)西藥、中醫(yī)中藥的作用機(jī)制，尋求最能緩解患者臨床癥狀，解除病痛的治療方法。針灸以獨(dú)特的治療優(yōu)勢(shì)被廣大患者接受，能有效緩解患者的癥狀{4,5]。為此，臨床科研人員開始對(duì)針灸治療骨質(zhì)疏松癥的效果及其機(jī)理進(jìn)行研究[6,7]。本文研究了電針刺對(duì)去卵巢大鼠的全身骨密度及其骨形成和骨吸收活性進(jìn)行了研究，為電針刺治療骨質(zhì)疏松癥的效果及其機(jī)理的研究提供幫助。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

電針(上海華誼醫(yī)用儀器有限公司)；雙能X線骨密度測(cè)定儀(美國(guó)GE公司)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：199A3)；兔IgG-免疫組化試劑盒SABC即用型(博士德生物工程有限公司，批號(hào)：11C31C SA1022)；OPG(ab183910，批號(hào)：GR154990-29)；RANKL(ab9957，批號(hào)：GR262704-1)；大鼠成骨細(xì)胞專用培養(yǎng)基(武漢普諾賽生命科技有限公司，批號(hào)：CM-R091)；PBS液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0111/A16)；通用細(xì)胞凍存液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：0111A16)；過氧化物酶阻斷液(博士德生物工程有限公司，批號(hào)：11C17B08)；DAB顯色試劑盒(博士德生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：11B23C22)； 載玻片(中國(guó)制造，批號(hào)：7105)；顯微鏡蓋玻片(中國(guó)制造，批號(hào)：10212020C)；針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠，Ф0.35 mm×13 mm)。

1.2 方法

1.2.1骨質(zhì)疏松癥模型大鼠的制備方法：選取SPF級(jí)2月齡SD雌性大鼠40只，隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物組和電針組，后3組采用手術(shù)方法切除雙側(cè)卵巢。將大鼠以0.3 mL/100 g的10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉，在其最末肋骨下一橫指且旁開脊柱有一小的隆起處，并剃去此處鼠毛，鋪無菌洞巾，以碘酊消毒。切開皮膚、背部肌肉、腹膜，以小鑷子輕輕將白色發(fā)亮脂肪團(tuán)拉出切口外，分離脂肪團(tuán)，便可見到粉色菜花樣卵巢。先將卵巢下端輸卵管用絲線結(jié)扎，然后摘除卵巢。切口縫合后，對(duì)皮，碘酊消毒，同法摘除另一側(cè)卵巢，造成骨質(zhì)疏松癥模型大鼠。造模后飼養(yǎng)13 w，檢測(cè)骨密度和骨礦物含量。

1.2.2動(dòng)物分組：空白組：不予任何處理，常規(guī)飼養(yǎng)。模型組：灌服與藥物組同體積的蒸餾水，常規(guī)飼養(yǎng)。藥物組：按照1 mL/100 g標(biāo)準(zhǔn)灌胃給予0.02 mg/mL戊酸雌二醇水溶液(大鼠給藥劑量按照人與大鼠體表面積比值折算而得)[8,9]，1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d。20 d1療程，治療3療程。電針組：“三陰交”穴位于后肢內(nèi)踝尖直上10 mm，直刺5 mm；“足三里”穴位于膝關(guān)節(jié)下側(cè)，腓骨小頭下緣5 mm處，直刺5 mm；“脾俞”穴位于第十一胸椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm；“腎俞”穴位于第2腰椎棘突下旁開1.5寸，直刺5 mm。以大鼠腳趾中指和同身寸法確定旁開位置和針刺深度剃去背部鼠毛，應(yīng)用針具及穴位常規(guī)消毒后，用30號(hào)0.5寸不銹鋼毫針快速刺入皮下一定深度，接入電針，頻率為2 Hz，斷續(xù)波[10,12]，刺激強(qiáng)度1.0 mA，以局部見肌肉輕微收縮為佳，每次15 min，同時(shí)灌服與藥物組同體積的蒸餾水。1次/1 d，連續(xù)治療5 d，間隔2 d。20 d1療程，治療3療程。

1.2.3全身骨密度檢測(cè)：治療3個(gè)月后，采用腹腔注射10%水合氯醛麻醉各組大鼠。待至大鼠處于全身迷醉狀態(tài)下(用拇指和食指掐其尾端，如果大鼠沒有甩尾動(dòng)作，顯示達(dá)到最佳測(cè)定時(shí)段)，將其依次置于骨密度測(cè)定儀器。將大鼠置于測(cè)定板上，使四肢，尾部全部集中于測(cè)定板上，使頭部，軀體和尾部處于測(cè)定板的縱端中線上，避免偏移，并使全身處于伸展?fàn)顟B(tài)。掃描全身，采用計(jì)算機(jī)顯示大鼠全身骨影像，保存掃描圖片，抄錄檢測(cè)數(shù)據(jù)[13-15]。

1.2.4大鼠成骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)：將乳鼠置于75%酒精中浸泡處死，無菌條件下取其顱骨并去除骨膜及結(jié)締組織，PBS 清洗3 次； 將骨片剪碎(大小約1 mm×1 mm×1 mm)，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，0.25%胰酶消化2 次(37℃，每次10 min)，棄去上清液，0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化10 min，棄上清；再用0.1% 的Ⅱ型膠原酶消化4 次(37℃，每次20 min)，收集合并上清液，加入5 mL 含血清的培養(yǎng)基中止酶消化，150 目濾網(wǎng)過濾3次，1 000 r /min 離心10 min；棄上清，加入培養(yǎng)基(α-MEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10% PBS)，吹打均勻并計(jì)數(shù)。原代細(xì)胞懸液以3×104/mL 接種于大皿(Nunc) 中培養(yǎng)，每皿10 mL，37 ℃、5% CO2和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，每3 d換液1 次。待細(xì)胞鋪滿80%培養(yǎng)皿后進(jìn)行爬片培養(yǎng)。

1.2.5成骨細(xì)胞的血清處理方法：采用10%水合氯醛(0.03 mL/100 g)麻醉各組大鼠，待大鼠麻醉充分后，用5 mL真空采血針對(duì)準(zhǔn)心臟部位扎取一定量血清，冷置1 h，離心(2 500 r/min，25 min)，棄去沉淀物，保留上層血清。將上層血清采用56℃水浴滅活30 min，并用0.22 um的濾網(wǎng)抽濾除菌。將各組制備血清依10%的比例加入爬片培養(yǎng)的成骨細(xì)胞3 d后，4%多聚甲醛固定10 min。采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法處理各組細(xì)胞爬片，并通過圖像分析處理軟件選取恰當(dāng)視野，提取灰度值，結(jié)果采用積分光密度(IOD)表示。

1.2.6免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法：各組成骨細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定10 min后，PBS清洗3次(每次3 min)，0.1% Triton X-100透膜10 min，清洗3次后加入30% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶。蒸餾水清洗3次，加入BSA封閉20 min，清洗后加入OPG 和RANKL一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜處理。PBS清洗3次(每次3 min)，滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)，滴加SABC試劑并37℃孵育20 min，PBS清洗3次(每次3 min)。使用DAB顯色后流水清洗，乙醇梯度脫水，樹脂封片，拍照采集照片。通過圖像分析處理軟件選取恰當(dāng)視野，采用Image-Pro Plus 6.0掃描光密度(IOD)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠全身骨密度BMD檢測(cè)結(jié)果

如表1所示，與空白組相比，模型組骨密度顯著降低(P<0.05)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，骨密度顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 大鼠全身骨礦物含量BMC檢測(cè)結(jié)果

如表2所示，與空白組相比，模型組骨礦物含量顯著降低(P<0.05)，說明去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠模型建立成功。經(jīng)過藥物或針刺處理后，骨礦物含量顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 各組大鼠全身BMD比較Table 1 Comparison of the whole body BMD in

注：*與空白組比較，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
**與模型組比較，P<0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠全身BMC含量的比較Table 2 Comparison of the whole body

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，**P<0.01

2.3 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖1、2所示，空白組OPG表達(dá)量最高，模型組最低，經(jīng)過藥物或針刺處理后，OPG表達(dá)顯著升高，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)Fig.1 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

圖2 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞OPG蛋白表達(dá)與模型組比較，**P<0.01Fig.2 The expression of osteoblasts OPG protein after processing of rat serum

2.4 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)結(jié)果

如圖3、4所示，空白組RANKL表達(dá)量最低，模型組最高，經(jīng)過藥物或針刺處理后，RANKL表達(dá)顯著下降，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖3 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of osteoblasts RANKL protein after processing of rat serum

圖4 大鼠血清處理后成骨細(xì)胞RANKL蛋白表達(dá)與模型組比較，**P<0.01Fig.4 The expression of osteoblasts RANK protein after processing of rat serum

3 討論

以往一系列實(shí)驗(yàn)[16-18]都對(duì)骨質(zhì)疏松大鼠有關(guān)于骨質(zhì)變化的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行了詳細(xì)的研究，結(jié)果均表明：針灸在骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防或是治療方面均能起到良好改善作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：針刺治療骨質(zhì)疏松癥可能是通過調(diào)控成骨細(xì)胞內(nèi)OPG、RANKL蛋白的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)OPG-RANKL-RANK信號(hào)通路，以此調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞骨破壞和成骨細(xì)胞骨重建系統(tǒng)的平衡，達(dá)到預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的效果，亦進(jìn)一步證實(shí)臨床上采用針灸治療多種原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥均能取得良好效果的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

中醫(yī)認(rèn)為，腎主骨生髓，脾主四肢肌肉，肝主筋。如《素問·六節(jié)臟象論》記載“腎者,封藏之本,精之處也,其華在發(fā),其充在骨。”可見，腎中精氣能夠化生為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，潤(rùn)養(yǎng)全身骨骼，保證骨骼的正常生長(zhǎng)代謝。同時(shí)，腎中精氣的后天充養(yǎng)有賴于后天脾胃的不斷補(bǔ)充才能延續(xù)生命。如《素問·生氣通天論》云“是故謹(jǐn)和五味,則骨正筋柔,氣血以流,胰理以密,如是則骨氣以精,謹(jǐn)?shù)廊绶?長(zhǎng)有天命。”再者，中醫(yī)理論認(rèn)為肝氣的條達(dá)、順暢有助于脾胃的正常運(yùn)化，從而腐熟水谷等精微物質(zhì)，不斷補(bǔ)充、滋養(yǎng)先天之臟。如《素問·上古天真論》云“肝氣衰則筋不能動(dòng)”；《經(jīng)脈別論》曰“食氣入胃,散精于肝,淫氣于筋”。所以本研究依據(jù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)選取了與肝脾腎三臟聯(lián)系最為密切的穴位，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性藥物組與之作對(duì)比。研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了以往研究結(jié)果：藥物和電針治療去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥均能取得療效，但是單純電針和藥物療效相比，前者略微較后者好。該研究為針灸學(xué)術(shù)界再添一項(xiàng)具有說服力的結(jié)果，亦能更好地為臨床采用針灸推拿治療骨質(zhì)疏松癥提供事實(shí)依據(jù)。同時(shí)，希望該研究領(lǐng)域的研究人員能更一步深入探索運(yùn)用針灸骨質(zhì)疏松癥的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容[19-21]。