生物化學教學中加強小分子非編碼RNA介紹的必要性

喬梁+劉彥禮

摘要：隨著高通量測序技術的發展，越來越多的小分子非編碼RNA（Small non-coding RNA，sncRNA）被人們發現，其介導的轉錄調控是生物體內一種新的調控模式。目前，microRNA（miRNA）、small interferi ng RNA（siRNA）和PIWl-interacti ng RNA（piRNA）是sncRNA中研究最為透徹的三個成員。筆者在簡述三者的生物合成及作用機制的基礎上，建議在《生物化學》的教學中增加sncRNA知識的介紹。

關鍵詞：小分子非編碼RNA；生物化學，教學

自從1993年在線蟲中發現首個非編碼RNA分子一lin-4并證明其調控功能后，開啟了研究基因組內“暗物質”的新時代。小分子非編碼RNA（sncRNA）是一類不編碼蛋白質的小RNA分子，長度小于200個核苷酸（Nucleotide，nt），通常約20-30 nt。近年的研究發現，sncRNA具有重要的調控功能，參與了生物體的各種活動，如生長發育、器官形成、細胞增殖分化和凋亡，以及多種疾病的發生等。經過數年的探索，miRNA、siRNA和piRNA的功能和分子機制已被深入研究。除此之外，其他類型的sncRNA正逐漸為人所知（表1）。這些發現提示我們生物體內可能存在著一種全新的調控模式，將有助于我們深入了解生物體復雜的調控網絡。

目前，sncRNA研究已成為生命科學和醫學研究的熱門領域，并獲得了2006年的諾貝爾生理學或醫學獎，但是在傳統《生物化學》課程的教學中嚴重缺乏sncRNA知識的介紹。在此，筆者簡要闡述sncRNA中研究深入的miRNA、siRNA和piRNA，從生物合成和作用機制入手，加強sncRNA知識的介紹，期望能夠為《生物化學》課程的教學提供參考。

一、miRNA的生物合成和作用機制

miRNA是一類長約20-24 nt的內源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，它可以通過mRNA剪切和抑制蛋白質翻譯的方式負調控靶基因。目前，人類有接近1/3的基因受到miRNA的調控。進一步研究表明，同一個miRNA存在眾多的靶基因，而同一個靶基因經常受到多個miRNA的共同調控，miRNA及其靶基因構建了生物體內全方位多層次的基因表達調控網絡系統。

miRNA基因由RNA聚合酶Ⅱ轉錄，產生原始的miRNA轉錄物（pri-miRNA），pri-miRNA在細胞核內經RNA內切酶Ⅲ一Drosha加工，得到miRNA前體（pre-miRNA）。然后被Exportin-5蛋白轉運到細胞質中，再經RNA內切酶Ⅲ一Dicer進一步加工得到約22個核苷酸的成熟雙鏈RNA分子（miRNA：miRNA*），其中一條成熟鏈（miRNA）插入RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencingcomplex，RISC）中形成miRISC行使功能，而另外一條鏈（miRNA*）會被快速降解。

miRNA通過兩種不同的機制下調靶基因的表達：mRNA剪切和翻譯抑制。miRNA作用靶基因的3非翻譯區（3UTR）內調控位點，以完全互補或不完全互補的形式結合，誘導靶基因mRNA降解或抑制蛋白翻譯，導致相應蛋白質合成缺失或減少，從而在轉錄后水平調控基因表達，進而參與生物體內某些生理及病理過程。絕大多數的植物miRNA與其靶基因幾乎完全互補，并且互補位點散布于整個mRNA而非局限于3UTR區，引發靶基因mRNA的降解。而絕大多數的動物miRNA與其靶基因互補程度較低，通過抑制翻譯的方式調控靶基因表達。

二、siRNA的生物合成和作用機制

siRNA是一類長約21bP（Base pair，bP）的小分子非編碼雙鏈RNA，同樣由Dicer切割完全互補的雙鏈RNA復合物產生，廣泛存在于真核生物中。早期（1999）發現外源導入細胞內的雙鏈小RNA分子（dsRNA）形成siRNA，通過RNAi途徑導致基因沉默，但是直到最近（2008）才在果蠅和哺乳動物中發現內源siRNA（Endogenous siRNA，endo-siRNA）?，F今，由外源性合成的siRNA引發RNAi導致目的基因沉默，已成為基因功能研究不可或缺的方法，而且在疾病治療中具有重要的意義。

外源性導入、病毒激活、轉座子侵入及特異重復序列等因素均可誘導dsRNA產生，dsRNA轉錄后被Dicer剪切生成21-22 nt、3末端2 nt突出的RNA二聚體。在RISC形成過程中，siRNA二聚體會解聚形成兩條單鏈siRNA，均可有效參與RISC的形成。同miRNA作用機制相同，siRNA可通過堿基互補配對與靶基因mRNA結合（結合位點一般都位于mRNA的中間部位），導致靶基因mRNA的裂解或降解。

endo-siRNA廣泛分布于真核生物中，成簇分布于生物體內的轉座子、假基因、基因內含子、外顯子以及間隔區等。endo-siRNA是由基因組中的重復序列（轉座子或反轉座子元件等）編碼，其主要功能有：第一，介導移動元件的基因沉默，導致靶基因的甲基化或靶基因mRNA的降解：第二，介導DNA的異染色質化；第三，調控基因組的重排。目前，雖然在endo-siRNA的主要特點及生物學功能上取得了一定的研究進展，仍有許多問題需要深入研究。

三、piRNA的生物合成和作用機制

piRNA是2006年發現的一類與生殖細胞特異性PIWI家族蛋白相互作用，長約26-30 nt的小分子非編碼RNA。PIWI蛋白為piRNA生物發生和功能形式所必須，piRNA對生殖細胞干性的維持、配子形成、胚胎發育等多種生殖相關事件至關重要。

piRNA來源于基因組中的piRNA簇或轉座子區域，有長的單鏈轉錄本切割產生。研究發現，piRNA生成有兩條途徑：初級生成途徑和次級生成途徑。與miRNA和siRNA不同的是，piRNA形成途徑都不需要Dicer的參與。在初級途徑中，長的單鏈轉錄本被某種核酸內切酶剪切形成5端帶有尿嘧啶的初級piRNA，隨后，初級piRNA完成3端的2氧甲基化修飾。研究推測果蠅中PIWI、Aub和Ag03蛋白可能就是這種核酸內切酶。

基于對果蠅和哺乳動物piRNA的分子結構特點，乒乓模型（Ping-pang model）被用來解釋piRNA從轉錄前體物中循環增生。首先，初級piRNA互補的轉錄產物被PIWI蛋白識別并激活PIWI的內切酶活性，初級piRNA被切割形成一條新的piRNA（次級piRNA）。其次，次級piRNA3端的腺嘌呤與初級piRNA 5端的尿嘧啶互補。同樣，次級piRNA也可通過識別和切割互補的RNA序列，產生新的piRNA，即次級生成的乒乓擴增途徑。

piRNA的作用機制與miRNA和siRNA不同，miRNA和siRNA主要通過Ago亞家族蛋白相互作用，而piRNA則是通過與PIWI蛋白結合形成piRNA復合物來發揮轉錄階段的基因沉默作用，可能取決于piRNA與靶基因mRNA的配對程度及參與調控的其他蛋白質因子等。

四、總結

miRNA、siRNA與piRNA的共性是它們都通過一種序列特異的方式指導效應蛋白結合到基因組位點或靶基因RNA上。同樣也存在著區別：第一，發生的生物途徑。miRNA是由具有“發夾”二級結構的pre-miRNA經Drosha和Dicer剪切加工形成。siRNA來源與長的dsRNA前體，經Dicer剪切形成。piRNA的生成途徑依賴PIWI蛋白，不需要Dicer的參與。第二，功能機制。miRNA是在轉錄后水平降解或抑制蛋白翻譯從而調控基因表達。siRNA主要功能是裝載至Ago蛋白介導蛋白編碼基因及轉座子等沉默。piRNA主要功能是介導生殖細胞內轉座子的沉默、生殖細胞的發育及完整等，通過表觀遺傳調控及轉錄后水平等發揮基因沉默作用。第三，分布特點。miRNA成簇分布在體細胞和生殖細胞中。endo-siRNA分布在體細胞和生殖細胞中，成簇的分布在動物體內的轉座子、假基因、基因內含子、外顯子以及間隔區等。piRNA主要分布在生殖細胞中，并主要成簇的分布在基因間隔區。

sncRNA在細胞分化、生物發育及疾病發生、發展過程中的作用拓展和豐富了以往人們對小分子RNA的認識。最新的高通量測序技術，將會使人們對真核生物基因表達調控網絡的理解提高到一個新的水平。對sncRNA不斷深入的研究，不僅在理論上豐富了我們對基因調控的認識，而且在實際應用中可以使sncRNA成為疾病診斷的新生物學標記和藥物靶標，最終為疾病治療提供新的策略和思路。因此，在《生物化學》的教學中增加sncRNA相關的知識介紹顯得尤為重要。我們可以從生物合成和作用機制等方面加強教學，有利于開拓學生的視野、培養學生的創新意識和科學素養，從而為培養高素質的醫學創新型人才做出積極的貢獻。