中國Peutz-Jeghers綜合征患者STK11基因突變檢測及高頻突變分析

蔣宇亮，李偉聰，趙子夜，李白容，毛旭艷，寧守斌*

(1.中國人民解放軍空軍總醫院消化科，北京 100142；2.河北北方學院研究生院，河北 張家口 075061；3.航天中心醫院老年2科，北京 100040；4.中國人民解放軍第二七三醫院外一科，新疆 庫爾勒 841007；5.北京市新華醫院消化科，北京 101100)

·論 著·

中國Peutz-Jeghers綜合征患者STK11基因突變檢測及高頻突變分析

蔣宇亮1,2，李偉聰3，趙子夜4，李白容1，毛旭艷5，寧守斌1*

(1.中國人民解放軍空軍總醫院消化科，北京 100142；2.河北北方學院研究生院，河北 張家口 075061；3.航天中心醫院老年2科，北京 100040；4.中國人民解放軍第二七三醫院外一科，新疆 庫爾勒 841007；5.北京市新華醫院消化科，北京 101100)

目的分析Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome，PJS)患者絲/蘇氨酸蛋白激酶11(serine/threonine kinase 11,STK11)基因突變情況，探討不同STK11基因突變與臨床特征的關系。方法選擇完成STK11所有外顯子基因測序的患者54例，分析其臨床表現及突變分布規律，并比較不同突變間臨床特征。結果54例患者中，33例在STK11基因編碼區檢測出點突變，先證者30例(檢出率58.8%，30/51)，家族突變檢出率為55.0%(11/20)，散發突變檢出率為55.9%(19/34)。3個家系共5例患者在同一位點突變(c.180C>G)，疑為高頻突變；另1個家系的2例患者突變位點一致(c.658C>T)；1例患者同時檢測到2個突變位點；剩余26例患者攜帶突變各不相同。c.180C>G首次發病年齡和首次手術年齡≤7歲患者中所占比例明顯高于其他突變，差異有統計學意義(P<0.05)；c.180C>G與其他突變在性別、家族史、腫瘤史、腹部癥狀、手術史差異均無統計學意義(P>0.05)。結論STK11基因突變是PJS發病的主要致病原因。發現1例可疑為高頻突變，該突變患者首次發生癥狀及接受首次手術年齡均低于其他突變患者，應在臨床監測及治療過程中多予以關注。

Peutz-Jeghers綜合征；p21活化激酶類；基因；突變

Peutz-Jeghers綜合征(Peutz-Jeghers syndrome,PJS)是一種罕見的以皮膚黏膜色素沉著和胃腸道多發息肉為主要表現的的常染色體顯性遺傳性疾病，30%～50% PJS患者有家族遺傳病史[1]。分子遺傳學研究表明，位于19號染色體短臂19p13.3區間的絲/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase 11, STK11 )基因是PJS的主要致病基因[2]，可發生基因的雜合性缺失、移碼突變或無義突變等，從而造成STK11 基因功能喪失。STK11 基因編碼區為1 302 bp，由9個外顯子組成，編碼相對分子質量為60 000的433個氨基酸組成的STK11，屬于一種環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)依賴的蛋白激酶，其功能催化區域位于第44～309位氨基酸殘基。PJ息肉可致急慢性腹痛、腸套疊、腸扭轉、腸梗阻、胃腸道出血等嚴重并發癥，其中以小腸套疊最常見[3]，通常發生于兒童期[4]。中國人民解放軍空軍總醫院應用PCR-DNA測序技術對54例中國PJS患者的STK11 基因編碼區進行檢測，其中發現1例高頻突變位點，并對其臨床相關因素進行了分析，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月—2015年1月在中國人民解放軍空軍總醫院臨床確診，并同時接受PCR擴增技術、DNA測序及序列比對分析的PJS患者54例。其中男性30例，女性24例，年齡10～51歲，平均(30.12±10.98)歲。包括17個家系20例患者，34例散發患者。本研究遵守赫爾辛基宣言并由中國人民解放軍空軍總醫院倫理委員會批準。征得所有患者及家屬同意，并簽署知情同意書。

1.2 納入標準及排除標準 納入標準：(1)入組的所有患者均符合PJS的診斷標準[4][即以下4條中的任何1條：①2個或多個息肉，經組織學診斷符合PJS特點，即起源于黏膜肌層的平滑肌像樹枝樣延伸至息肉的黏膜下層，稱之為PJ息肉(圖1)；②具有PJS家族史且伴有任何數量的PJ息肉；③具有PJS家族史且典型的皮膚黏膜色素沉著；④典型的皮膚黏膜色素沉著且伴有任何數量的PJ息肉]；(2)均抽取外周靜脈血，提取基因組DNA，應用PCR擴增技術及DNA測序方法檢測STK11基因編碼區序列。排除標準：不能同時滿足以上2項納入標準者。

圖1 PJ息肉光鏡下表現(HE ×10)

Figure 1 Performance of PJ polyps tissue under light microscope(HE ×10)

1.3 研究方法

1.3.1 DNA提取 PJS患者均抽取外周靜脈血2～4 mL，EDTA-K2抗凝。應用血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化公司、上海南方基因科技有限公司)方法提取基因組DNA，經紫外分光光度法檢測DNA的濃度及純度。-20 ℃保存備用。

1.3.2 引物設計 應用Primer 5.0軟件設計引物，引物合成由軍事醫學科學院合成生物學實驗室、上海南方基因科技有限公司完成。

1.3.3 PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳 對以上STK11外顯子區域在PCR儀器上進行PCR擴增，并用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增效果。

1.3.4 DNA測序 對PCR擴增產物純化后應用DNA全自動測序儀進行測序，測序反應引物同時擴增產物，測序產物用MEGA 6.05軟件進行序列分析，并將測序結果與基因庫中提供的STK11基因進行對比。

1.4 統計學方法 應用SPSS 18.0統計學軟件分析數據。計數資料比較采用Fisher精確檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PCR擴增產物電泳分析結果 54例PJS患者提取的DNA樣本擴增后所獲得的PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果表明PCR擴增產物長度符合目的片段理論值且特異性好。

2.2 DNA測序結果及分析

2.2.1 突變總體檢出情況 54例PJS患者序列比對發現33例患者存在STK11基因編碼區的突變，30例為先證者，先證者點突變檢出率為58.8%(30/51)，其中錯義突變占80.0%(24/30)，刪除突變占10.0%(3/30)，插入突變占10.0%(3/30)。家族突變檢出率為55.0%(11/20)，散發突變檢出率為55.9%(19/34)。3個家系共5例患者在同一位點突變(c.180C>G)，疑為高頻突變；另1個家系的2例患者突變位點一致(c.658C>T)；1例患者(PJS12)同時檢測到2個突變位點(c.250A>T，c.1 062C>G)，該患者第250位密碼子A>T的突變引起K84X，在第84位氨基酸形成終止密碼子，考慮c.1 062C>G為多態性位點；剩余26例患者攜帶突變各不相同。其余21例患者STK11基因編碼區未檢測到點突變。有家族史患者14例，無家族史患者19例，比例為1∶1.3。男性18例，女性15例，男女比例1∶0.83。見表1。

表1 33例PJS患者STK11基因編碼區突變情況Table 1 Mutation of STK11 gene coding region in 33 patients with PJS

2.2.2 c.180C>G臨床特征 本組樣本平均發病年齡為5.8歲(1～14歲)；男性占比高(80.0%，4/5)；均無腫瘤家族史；均因腹痛、嘔吐發病就診；4～7歲為高發年齡段；80.0%(4/5)患者因腸梗阻、腸套疊首次接受手術。見表2。

2.2.3 c.180C>G與其他突變相關特征比較 c.180C>G首次發病年齡和首次手術年齡≤7歲患者中所占比例明顯高于其他突變，差異有統計學意義(P<0.05)；c.180C>G與其他突變在性別、家族史、腫瘤史、腹部癥狀、手術史差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表2 c.180C>G患者臨床特征Table 2 Clinical characteristics of patients with c.180C>G

*1例未行手術

表3 c.180C>G與其他突變患者的相關特征比較Table 3 Comparison of the related characteristics of patients with c.180C>G and other mutations (例數)

注：Fisher精確檢驗；*3例無腹部癥狀；#9例未行手術

3 討 論

PJS是一種常染色顯性遺傳病，主要表現為黏膜色素沉著斑、胃腸道多發息肉和隨年齡增長的腫瘤風險。該病發病率為1/50 000～1/200 000。目前認為該病的主要致病基因是位于19p13.3區域的STK11基因，該基因是一種抑癌基因[5]。STK11基因的功能復雜，目前尚未完全闡述明確。歐美相關研究證實其通過調節細胞周期和細胞極化發揮作用[6-7]，位于該基因編碼區的突變可能導致編碼蛋白的功能失活或缺失。迄今為止，在人類基因突變庫(human gene mutations database,HGMD)中已鑒定出的STK11基因突變有396種。目前國外研究STK11突變檢出率在66%～94%之間[8]，我國學者對52個家系共116例患者使用Sanger聯合MLPA進行基因檢測，突變檢出率達67.3%，其中點突變檢出率為51.9%，大段缺失檢出率為15.4%，家族性病例突變檢出率為80.0%，散發病例檢出率為55.6%[9]。本研究結果顯示，點突變檢出率為58.8%，家族點突變檢出率為55.0%，散發點突變檢出率為55.9%，點突變與國內數據結果相近。因本研究未對未檢出突變患者進行MLPA大段缺失檢測，故家族性、散發性突變檢出率存在一定差異。

值得注意的是，在33例可檢測到突變患者中，共有5例患者有相同突變(c.180C>G)，其中1例為散發患者，4例分布于2個不同家系，疑似為高頻突變位點。國內學者在研究中檢測到2例患者攜帶該突變，且呈家族性分布，因患者分布地區各不相同，故排除同一患者可能[10-11]。國外研究也報道了2例該突變[12-13]。對5例相同突變患者的臨床特征分析：①其中以家系分布為主(80.0%，4/5)，國內學者報道2例突變均有PJS家族病史；②上述患者均未患腫瘤及無腫瘤家族史，國內報道也否認患者腫瘤家族史；③均有口唇及四肢末端黑斑表現，并以腹痛、嘔吐為首發癥狀(100.0%，5/5)，平均年齡為5.8歲(1～14歲)，其中4例患者因腸梗阻、腸套疊接受手術(80.0%，4/5)，平均年齡為11歲(4～21歲)。根據以上臨床特點，考慮c.180C>G突變患者存在典型的口唇黑斑臨床表現，且有家族分布傾向，首次因腸梗阻、腸套疊接受手術的平均年齡早于國內(17.29歲)[9]和國外(16歲)[14]研究數據。

STK11主要由N末端核定位信號結構域、高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域和C末端調節結構域組成[15]，其激酶催化區域位于第44～309位氨基酸殘基。本研究結果顯示，高頻突變位于1號外顯子第180位堿基處C>G的錯義突變，可導致編碼STK11蛋白激酶第60位氨基酸形成終止密碼子(TAC→TAG)，進而產生截斷蛋白。國外研究表明位于激酶區的基因突變，可能干擾與STRAD和MO25結合形成復合體，從而破壞激酶活化功能[16]。此外，STK11的C端是與STRAD結合的區域，該區域的突變可能減弱AMPK的活性，進一步影響細胞極性和下游信號通路。該位點的突變導致部分激酶區域的缺失和C端調節區的完全缺失，通過影響生長周期、凋亡及細胞極化等機制，促進息肉的生長和腫瘤的發生。

在與其他突變臨床特征比較時發現，c.180C>G在性別、家族史、腫瘤史、有無腹部癥狀、手術史等方面差異無統計學意義。因PJS患者腸梗阻及腸套疊等息肉相關并發癥通常發生于兒童期[4]，故將對并發癥的研究年齡7歲為界，分為≤7歲(兒童組)和>7歲組。在對不同突變組與首次發病(腹痛、嘔吐)年齡進行比較時發現，在年齡≤7歲構成比方面，c.180C>G突變組明顯高于其他突變組。與此相似，與首次接受手術年齡的關系研究中，c.180C>G組在年齡≤7歲的構成比也高于其他突變組。所以，c.180C>G突變除有典型的PJS臨床表現外，還有傾向于年齡≤7歲時首次發生癥狀和首次接受手術的特點。而這一表現可能與突變所導致的激酶區域的缺失和C端調節區的完全缺失有關。在對PJS患者的息肉切除過程中，發現對于大體積的息肉使用內鏡黏膜切除術可有效地減少術中及術后出血量，這一發現與我國學者研究結果類似[17]。

總之，通過對54例患者突變檢測的回顧，發現疑似高頻突變1例，對其臨床表型進行分析，是在基因-表型關聯方面的一次有益嘗試，并為臨床早期干預及治療PJS提供了理論基礎。

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(本文編輯：趙麗潔)

Detection of STK11 gene mutation in Chinese Peutz-Jeghers syndrome patients and high frequency mutation analysis

JIANG Yu-liang1,2, LI Wei-cong3, ZHAO Zi-ye4, LI Bai-rong1, MAO Xu-yan5, NING Shou-bin1*

(1.DepartmentofGastroenterology,AirForceGeneralHospitalofPLA,Beijing100142,China; 2.HebeiNorthUniversityGraduateCollege,HebeiProvince,Zhangjiakou075061,China; 3.TheSecondDepartmentofGeriatrics,AerospaceCentralHospital,Beijing100040,China; 4.TheFirstDepartmentofSurgery,the273rdHospitalofPLA,Korla841007,China; 5.DepartmentofGastroenterology,XinhuaHospital,Beijing101100,China)

Objective To analyze serine/threonine kinase 11 (STK11) gene in patients with Peutz-Jeghers syndrome(PJS), and explore the relationship between different mutations and clinical features. Methods The sequencing of STK11 gene coding region was analyzed from 54 inpatients with PJS. Their clinical manifestations and mutations were analyzed. The clinical characteristics of different mutations were compared. Results Of the 54 patients with PJS, 33 cases were found to have mutations in the coding region of STK11 gene. Among them, 30 cases were probands (the mutation detection rate was 58.8%, 30/51), the mutation detection rate of familial patient was 55.0%(11/20), and the mutation detection rate sporadic patient was 55.9%(19/34). The 5 patients from 3 families had the same point mutation(c.180C>G), which was suspected high frequency mutation. In another family, 2 patients also had the same mutation(c.658C>T). A patient had two mutations; the other 26 patients had a single mutation site. The proportion of patients with c.180C>G in the first onset age and the first surgery age<7 years of age were significantly higher than other mutations, the difference was statistically significant(P<0.05). There were no significant differences in gender, family history, tumor history, abdominal symptoms, and surgical history. Conclusion STK11 gene mutation is the main pathogenicity of PJS. A high frequency mutations were found, patients with this mutation had symptoms and undergo surgery earlier than other patients. We should pay more attention in clinical monitoring and treatment.

Peutz-Jeghers syndrome； p21-activated kinases； genes； mutation

2017-06-14；

2017-07-07

中國人民解放軍空軍總醫院年度計劃課題(kz2015026，kz2016021)

蔣宇亮(1986-)，男，內蒙古包頭人，河北北方學院醫學碩士研究生，從事消化疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail:ning-shoubin@163.com

R574;R730.269

A

1007-3205(2017)08-0878-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.08.003