一測(cè)多評(píng)法測(cè)定沙棘鮮果中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量

劉 峰，馬久太，王浩仁，李 瑾，黨艷妮，李 煒

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710061）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

一測(cè)多評(píng)法測(cè)定沙棘鮮果中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量

劉 峰1，2，馬久太1，王浩仁1，李 瑾1，黨艷妮1，李 煒1，2

（1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712046； 2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，陜西 西安 710061）

目的建立一測(cè)多評(píng)法測(cè)定沙棘果中槲皮素、山柰素和異鼠李素3種成分的含量，并驗(yàn)證其在沙棘果質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用價(jià)值。方法色譜柱采用Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇－0.4%磷酸溶液（56∶54），流速為1.0 mL／min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 L，檢測(cè)波長(zhǎng)370 nm。以槲皮素為對(duì)照品，建立其與山柰素、異鼠李素的相對(duì)校正因子，并用該校正因子計(jì)算各成分含量，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)，同時(shí)采用外標(biāo)法驗(yàn)證一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性和可行性。結(jié)果槲皮素與山柰素、異鼠李素的相對(duì)校正因子分別為0.949 9和1.027 5，一測(cè)多評(píng)法的計(jì)算值與外標(biāo)法實(shí)測(cè)值間無(wú)顯著差異。結(jié)論以槲皮素為對(duì)照品，同時(shí)測(cè)定沙棘果中槲皮素、山柰素、異鼠李素的一測(cè)多評(píng)法準(zhǔn)確可靠，可為沙棘果中黃酮類(lèi)成分的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

一測(cè)多評(píng)；沙棘果；槲皮素；山柰素；異鼠李素；含量測(cè)定

沙棘是胡頹子科沙棘屬 Hippophae rhamnoides L.漿果植物，又名酸刺、黑刺、醋柳，為落葉灌木或木喬，廣布于我國(guó)青海、新疆、內(nèi)蒙、陜西等地，在保持水土、改善環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用。以沙棘果為原料可制成多種制劑如沙棘片、沙棘膏、心達(dá)康片等，沙棘黃酮為沙棘果中主要的活性成分[1]，具有抗心肌缺血、抗心律失常、提高耐缺氧能力、降低血清膽固醇等廣泛的藥理功效。臨床試驗(yàn)證明，沙棘黃酮具有治療缺血性心臟病、心絞痛、心肌缺血等疾病的作用[2]。沙棘黃酮按化學(xué)結(jié)構(gòu)分為6類(lèi)約32種，以槲皮素、異鼠李素、山柰素及其苷類(lèi)為優(yōu)勢(shì)活性成分。本研究中參考文獻(xiàn)[3－10]，采用一測(cè)多評(píng)(QAMS)法，建立了以槲皮素為對(duì)照品，測(cè)定沙棘果槲皮素、山柰素和異鼠李素含量的方法，具有簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、專(zhuān)屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，可為沙棘果中黃酮類(lèi)成分的質(zhì)量控制研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀(Waters公司)；LC－2010AHT型高效液相色譜儀(島津公司)；AR1140，DV215CD型電子天平（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；TDL－5－A型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)）；優(yōu)普UPT－Ⅱ－5L型超純水機(jī)（成都超純科技有限公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品槲皮素（批號(hào)為 100081－200907，含量為96.5%），山柰素（批號(hào)為 110861－201209，含量為93.2%），異鼠李素（批號(hào)為 110860－200406，含量為99.9%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。甲醇為色譜純（美國(guó)Fisher）；磷酸為色譜純，鹽酸為分析純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），水為超純水。沙棘果分別采自陜西延安市、甘肅臨夏州、寧夏固原市和陜西咸陽(yáng)市，經(jīng)陜西省食品藥品檢驗(yàn)所郭耀武主任藥師鑒定為胡頹子科植物沙棘 Hippophae rhamnoides L.的果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 QAMS的建立

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.4%磷酸溶液（56∶44）；檢測(cè)波長(zhǎng)：370 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL／min；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下，各成分分離良好，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

分別稱(chēng)取槲皮素、山柰素和異鼠李素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，制成含槲皮素、山柰素和異鼠李素質(zhì)量濃度分別為0.032 46，0.010 26，0.142 4 g／L的混合對(duì)照品溶液。取沙棘果約100 g，精密稱(chēng)定，除去沙棘籽，果肉攪拌均勻，稱(chēng)重，取約15 g，精密稱(chēng)定，加乙醇30 mL，攪拌均勻，加熱回流1 h，離心，棄去油層，沉淀及上清液攪拌均勻，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加鹽酸6.0 mL，混勻，加熱回流1 h，放涼，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[11－15]。

2.1.3 方法學(xué)考察

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液3，5，10，15，20 μL，分別注入色譜儀，測(cè)定，記錄峰面積。以混合對(duì)照品進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 3種成分線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，按照2.1.1項(xiàng)色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取沙棘果（陜西延安市）樣品，平行6份，分別按 2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表3，表明該方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一份制備好的供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表4，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取沙棘果（陜西延安市）約100 g，精密稱(chēng)定，平行6份，除去沙棘籽，果肉攪拌均勻，稱(chēng)重，精密稱(chēng)定約7.5 g，分別加入混合對(duì)照液 10 mL（槲皮素0.082 g／L，山柰素0.025 87 g／L；異鼠李素0.379 2 g／L），加乙醇20 mL，后續(xù)按照2.1.2項(xiàng)方法制備供試品溶液，測(cè)定并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表5，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2 校正因子計(jì)算

取混合對(duì)照品溶液，在2.1.1項(xiàng)色譜條件下，取3，5，10，15，20 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，以槲皮素為對(duì)照，按公式計(jì)算。fsi＝fs／fi＝(AS／CS)／(Ai／Ci)，式中 AS為對(duì)照品峰面積，CS為對(duì)照品質(zhì)量濃度；Ai為待測(cè)成分對(duì)照品峰面積，Ci為某待測(cè)成分對(duì)照品濃度。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 槲皮素與山柰素、異鼠李素的相對(duì)校正因子

2.3 相對(duì)校正因子與相對(duì)保留時(shí)間重現(xiàn)性考察

2.3.1 不同高效色譜儀和色譜柱的考察

取2.1.2項(xiàng)下已制備好的混合對(duì)照品，按照擬訂色譜條件分別考察島津LC－2010AHT及Waters e2695高效液相色譜儀；Agilent XDB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Kromasil 100－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），Thermo Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱的相對(duì)校正因子。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 不同色譜儀和色譜柱相對(duì)校正因子考察（n＝5）

2.3.2 待測(cè)組分色譜峰的定位

按照2.3.1項(xiàng)方法進(jìn)樣，測(cè)定并計(jì)算待測(cè)成分山柰素和異鼠李素與對(duì)照品槲皮素的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）。結(jié)果見(jiàn)8。

2.4 測(cè)定結(jié)果比較

按2.1.2項(xiàng)下方法制備不同產(chǎn)地沙棘果供試品溶液，照2.1.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定。采用外標(biāo)法（ESM）和QAMS法同時(shí)測(cè)定樣品中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量。結(jié)果見(jiàn)表9。

表8 不同色譜儀和色譜柱RRT考察（n＝5）

表9 QAMS與ESM測(cè)定沙棘果中黃酮類(lèi)成分的含量比較（mg／g，n＝5）

通過(guò)計(jì)算ESM法實(shí)測(cè)含量與QAMS法計(jì)算的含量之間的夾角余弦值驗(yàn)證QAMS法的準(zhǔn)確性[16]。外標(biāo)法和一測(cè)多評(píng)法測(cè)得的山柰素、異鼠李素含量之間的夾角余弦值分別為0.999 95，0.999 98，表明兩種方法測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，建立的QAMS法可用于沙棘果黃酮類(lèi)成分的多指標(biāo)成分質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3 討論

3.1 提取方式選擇

沙棘黃酮類(lèi)成分富集于果肉和果皮中[17]，為減少油脂等其他成分對(duì)檢測(cè)的影響，在供試品溶液的制備時(shí)采用擠壓除去沙棘籽。另外，沙棘果肉中果油含量較高，曾試驗(yàn)用有機(jī)溶劑萃取，除去沙棘果油，但在萃取過(guò)程中易發(fā)生乳化，影響后續(xù)操作，故選擇離心方法除去沙棘果油。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

分別取槲皮素、山柰素和異鼠李素的對(duì)照品溶液在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果槲皮素在255.6 nm和370.1 nm有較大吸收峰，山柰素在264.0 nm和 370.0 nm處吸收較大，異鼠李素在 254.5 nm和370.1 nm處吸收大。根據(jù)各成分的吸收情況，選擇370 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

3.3 方法優(yōu)勢(shì)

QAMS法使用一種對(duì)照物質(zhì)，利用相對(duì)校正因子同時(shí)測(cè)定多種成分含量，可選易得、廉價(jià)的典型成分測(cè)定多種成分的含量[6－7]，大大節(jié)省了檢驗(yàn)成本，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作，提高了工作效率。槲皮素、山柰素和異鼠李素均為黃酮類(lèi)化合物，以槲皮素為對(duì)照品測(cè)定3種成分含量，可滿(mǎn)足QAMS法測(cè)定要求[6，16]，可為沙棘鮮果的質(zhì)量控制提供了一種簡(jiǎn)單、可靠的方法。

[1]高錦明，張鞍靈，李蕓生，等.沙棘黃酮化學(xué)研究的進(jìn)展[J].沙棘，1998，11（2）：34－40.

[2]顧清萍.沙棘藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)和利用[J].國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)，2003，1（2）：28－31.

[3]郭燕娜，胡華杰.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定垂盆草顆粒中槲皮素、山柰素和異鼠李素含量[J].中國(guó)生化藥物雜志，2016，36（4）：199－202.

[4]王甫成，龔道峰，時(shí)維靜，等.一測(cè)多評(píng)法研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22（13）：1－5.

[5]劉 雯，李 峰，楊建昕，等.一測(cè)多評(píng)法測(cè)定阿膠中4種氨基酸的含量[J].中藥材，2016，39（5）：1090－1093.

[6]高慧敏，宋宗華，王智民，等.適合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)模式－QAMS研究概況[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37（4）：405－416.

[7]王智民，錢(qián)忠直，張啟偉，等.一測(cè)多評(píng)法建立的技術(shù)指南[J].中國(guó)中藥雜志，2011，36（6）：657－658.

[8]陸兔林，石上梅，蔡寶昌，等.基于一測(cè)多評(píng)的中藥多成分定量研究進(jìn)展[J].中草藥，2012，43（12）：2525－2529.

[9]朱晶晶，王智民，高慧敏，等.一測(cè)多評(píng)法在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（16）：220－228.

[10]范成杰.“一測(cè)多評(píng)”法在中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制中的應(yīng)用概況[J].中藥與臨床，2013，4（2）：18－20.

[11]衛(wèi) 罡，侯 霄.HPLC法測(cè)定沙棘黃酮粉中槲皮素、山柰素和異鼠李素的含量[J].國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)，2014，12（2）：22－34.

[12]薄海波，陳立仁.高效液相色譜－紫外檢測(cè)法同時(shí)測(cè)定沙棘飲料中槲皮素、山柰素和異鼠李素[J].飲料工業(yè)，2004，7（2）：42－45.

[13]劉亞蓉.HPLC法同時(shí)測(cè)定沙棘膏中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量[J].藥物分析雜志，2008，2（5）：759－761.

[14]樊鑫梅，申雪麗，閆麗麗，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定沙棘果中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（17）：1343－1346.

[15]左小川，李健萍，曾曉瑜.醋柳黃酮的水解條件研究[J].中國(guó)藥業(yè)，2008，17（15）：23－24.

[16]王智民，高慧敏，付雪濤，等.“一測(cè)多評(píng)”法中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)模式方法學(xué)研究[J].中國(guó)中藥雜志，2006，23（12）：1925－1928.

[17]張慧娟，陳佳佳，蘇琴琴，等.沙棘果肉黃酮與沙棘籽黃酮之槲皮素、山奈酚和異鼠李素含量的比較[J].中國(guó)中醫(yī)藥科技，2016，23（5）：554－562.

Content Determination of Quercetin,Kaempferide and Isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.by Quantitative Analysis of M ulti－Components by Single M arker

Liu Feng1,2,Ma Jiutai1,Wang Haoren1,Li Jin1,Dang Yanni1,Li Wei1,2
(1.Shaanxi Institute of International Trade Commerce,Xianyang,Shaanxi,China 712046; 2.Shaanxi Buchang Pharmaceutical Co.LTD.,Xi′an,Shaanxi,China 710061)

Objective To establish a quantitative analysis of multi－components by single marker(QAMS)method for determing the content of quercetin,kaempferide,isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.,and test the application value of QAMS in the quality control of Hippophae Rhamnoides L..M ethods The Agilent C18column(250 mm×4.6 mm,5 μm)was adopted,the mobile phase was methol－0.4% phosphoric acid solution(56∶44),the flow rate was 1.0 mL／min,the column temperature was 30℃,the injection volume was 10 μL,and the detection wavelength was set at 370 nm.By using quercetin as reference,the relative correction factors(RCF)of kaempferol and isorhmnetin were calculated.The method was evaluated by comparison of the quantitative results through external standard method and QAMS method.Results The RCF of kaempferide and isohamnetin with reference to quercetin were 0.949 9,1.027 5.There isno significantdifference between the calculated value ofQAMS method and the measured value ofexternalstandard method.Conclusion With the quercetin as reference,simultaneous determination of quercetin,kaempferide,isohamnetin in Hippophae Rhamnoides L.by QAMS method is accurate and reliable,which can provide scientific basis for the quality control of the flavonoids in Hippophae Rhamnoides L..

quantitative analysis of multi－components by single marker;Hippophae Rhamnoides L.;quercetin;kaempferide;isohamnetin; content determination

R284.1

A

1006－4931(2017)13－0024－04

2017－03－03；

2017－04－18)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.13.007

陜西省重點(diǎn)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃[2015KCT－19]；陜西省創(chuàng)新藥物研究中心項(xiàng)目[2015SF2－09]；陜西省咸陽(yáng)市重大科技專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃項(xiàng)目[2014k01－18]。

劉峰（1969－），男，博士研究生，主任藥師，研究方向?yàn)樾滤幯邪l(fā)，（電子信箱）xinyao21＠126.com。