乳桿菌ALAC-3產抑酵母菌活性物質培養基的優化

（內蒙古農業大學，食品科學與工程學院，呼和浩特010018）

乳桿菌ALAC-3產抑酵母菌活性物質培養基的優化

鄭中文，李曉婷，劉靜，高鶴塵，李海暄，趙潔，陳忠軍

（內蒙古農業大學，食品科學與工程學院，呼和浩特010018）

從內蒙古傳統乳酸發酵食品中篩選出具有較強抑酵母菌作用的一株乳桿菌ALAC-3。從8組適合乳桿菌菌株生長的培養基中篩選出代謝產生抑酵母活性物質的最優培養基，再通過單因素和正交實驗，確定培養基中最適宜組分和適宜添加量。結果表明，碳源、氮源對菌株產抑菌物質有顯著的影響，最優培養基為：蔗糖25 g/L，蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L，K+：Mg2+：Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L，生長因子乙醇2 mL/L。以此培養基培養ALAC-3，其抑菌圈可達32.68 mm，比培養基優化前（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

乳桿菌；抑酵母菌作用；培養基；優化

0 引言

食品在生產到銷售過程中易混入病原菌和腐敗菌，危害消費者健康[1]。近年食品安全事故頻發就是這一危害不斷擴大的結果[2]，而以酵母菌等真菌的污染最嚴重。據統計，每年因酵母菌污染而浪費的糧食達2%[3]。

乳桿菌作為益生菌，可以提高食品營養、保藏性和附加值，改善食品風味[4-5]。同時，乳桿菌能夠調節機體腸道菌群，降膽固醇[6-8]，對機體生理功能、免疫反應等產生作用[9]，被廣泛用于工業生產[10]。目前研究發現，乳桿菌代謝可產生對近源或同種菌種有特異性抑制作用的細菌素[11]，但對酵母菌等真菌作用不明顯[12]。

本研究從內蒙古發酵食品中分離出具有抑酵母菌特性的乳桿菌ALAC-3，通過優化其培養基組分，以獲得最大抑菌物質產量，為該抑菌活性物質的進一步分離純化和結構分析提供參考。

1 實驗

1.1 材料與儀器

乳桿菌：ALAC-3，分離自內蒙古傳統發酵食品中。

指示菌：白假絲酵母（Candida albicans）標準菌株，編號為32819，來自中國工業微生物菌種保藏管理中心。

酵母膏，牛肉膏，胰蛋白胨，大豆蛋白胨，細菌學蛋白胨，氯化鈉，檸檬酸氫二胺，磷酸氫二鉀，硫酸錳，硫酸鎂，葡萄糖，瓊脂粉，硫酸銨，TWEEN 80，無水氯化鈣，Trizma堿，無水甲醇，冰乙酸，Bromophenol blue，均為分析純。

篩選用培養基：M17肉湯培養基，改良番茄汁培養基，番茄汁分離培養基，改良MC培養基，MRS肉湯培養基，莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養基，乳酸桿菌肉湯培養基，Elliker肉湯培養基。各培養基配方及編號如表1所示[13]。

SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺，BCD-249CF美菱冰箱，DPX-9162B-1電熱恒溫培養箱，可見分光光度計，KDC-140HR高速冷凍離心機，HPX-9052 MBE數顯電熱培養箱，L600低速自動平衡離心機，旋轉蒸發儀。

1.2 方法

1.2.1 ALAC-3生長培養基的篩選

（1）各培養基的配制。按表1所示將各組分依次加入，攪拌均勻，調節pH值，滅菌。

表1 篩選用培養基及配方g/L

（2）ALAC-3抑菌物質濃縮液的處理。將充分活化后的ALAC-3按4%接種量分別接種到各篩選培養基中，在30℃溫度下培養36 h，發酵液經過去酸化去除有機酸后離心分離去沉淀（4 000 r/min，10 min），上清液按4%比例濃縮，即為抑菌活性物質濃縮液[14]。

（3）牛津杯法測定抑菌性。牛津杯法，全稱是牛津杯雙層瓊脂擴散法，方法是將已滅菌的瓊脂培養基加熱到完全融化，倒入培養皿內，每皿15 mL（下層），待其冷卻凝固后在固體瓊脂上均勻放置3只牛津杯。將融化的指示菌（白假絲酵母）培養基冷卻到50℃左右接入指示菌，將混有指示菌的培養基5 mL加到已凝固的培養基上待凝固（上層）。在牛津杯中分別加入等量抑菌物質濃縮液，37℃培養16～18 h。在培養皿中，一方面指示菌開始生長，另一方面抑菌物質濃縮液呈球面擴散，離杯越近，濃縮液濃度越大，離杯越遠則濃度越小。隨著濃縮液濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就是“抑菌圈”。抗生素濃度越高，抑菌性越強，抑菌圈越大，從而抑菌圈的直徑可以指示其抑菌性強弱（抑菌物質濃度大小）[15]。

（4）ALAC-3生長培養基的篩選。分別收集各篩選培養基培養出的ALAC-3的抑菌物質濃縮液，按牛津杯法測定其抑菌性，濃縮液添加量均為1 mL，37℃下培養16～18 h，測量抑菌圈直徑。比較抑菌圈直徑大小，選擇抑菌圈最大的濃縮液對應的培養基為最佳培養基。

1.2.2 培養基組分和含量的優化

（1）單因素實驗。碳源：從常用碳源中選取葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖、麥芽糖11種糖作為碳源等量替換原培養基中的碳源，接入ALAC-3培養后按1.2.1（2）所示方法收集濃縮液，牛津杯法測定抑菌性，比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應的碳源。

氮源：選取蛋白胨、牛肉膏和酵母膏的不同比例組合作為氮源，等量替換原氮源，具體方法同上。比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應的氮源。

金屬離子：選取Na+、K+、Mn2+、Mg2+的不同比例組合作為金屬離子，替換原培養基中的金屬離子，方法同上。比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應的金屬離子。

生長因子：選取吐溫20（Tween 20）、吐溫80（Tween 80）、PEG-400、乙醇作為生長因子，方法同上，比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應的生長因子。

（2）正交實驗設計。根據單因素試驗結果，選擇碳源、氮源、金屬離子和生長因子作4因素3水平的正交試驗設計，按L9（34）正交表設計試驗。分析試驗結果，確定最優培養基組分及含量。

2 結果與討論

2.1 ALAC-3生長培養基的篩選

使用表1中8種不同的培養基培養ALAC-3，測定抑菌物質濃縮液的抑菌圈直徑，結果如表2所示。

表2 不同培養基對抑菌物質濃縮液抑菌性的影響

由表2可以看出，5號培養基抑菌物質濃縮液的抑菌圈最大；2，3，4號培養基培養ALAC-3時，菌體無法生長或者無法代謝產生抑菌物質。因此，根據試驗結果選定MRS肉湯培養基作為后期優化用的培養基。

2.2 優化培養基組分和含量

微生物培養基的組成大致分為碳源（C源）、氮源（N源）、金屬離子、生長因子。在單因素試驗中，分別用不同碳源、氮源、金屬離子、生長因子等量替換原培養基中的相應成分，比較替換前后ALAC-3產生的抑菌物質抑菌性強弱，從而確定各類組分的最佳成分和適宜添加量范圍[16]。

2.2.1 不同碳源對抑菌性的影響

選用不同的碳源代替原培養基中的碳源時，所得抑菌物質濃縮液的抑菌情況如圖1。

圖1 不同碳源對抑菌物質抑菌性的影響

由圖1可以看出，甘露糖作為碳源時所得抑菌物質濃縮液的抑菌圈最大，蔗糖次之，且數值低不到3%。考慮到甘露糖價格較高，以蔗糖作為較優碳源。

2.2.2 不同氮源對抑菌性的影響

選用不同的氮源代替原培養基中的氮源，所得抑菌物質濃縮液的抑菌情況如圖2所示。

圖2 不同氮源對抑菌物質抑菌性的影響

圖2中，橫坐標數值1為蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶2∶1）；2為蛋白胨；3為牛肉膏；4為酵母膏；5為蛋白胨∶牛肉膏（5∶3）；6為蛋白胨∶酵母膏（5∶3）；7為牛肉膏∶酵母膏（1∶1）；8為蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）。

由圖2可以看出，8號氮源時所獲得抑菌圈最大，即蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）作為培養基的氮源。

2.2.3 不同金屬離子對抑菌性的影響

選用不同金屬離子代替原培養基中的組分，實驗結果如圖3所示。

圖3 不同金屬離子對抑菌物質抑菌性的影響

圖3中，橫坐標數值1為Na+∶K+∶Mg2+∶Mn2+（30∶10∶3∶1）；2為Na+∶Mg2+（10∶1）；3為Na+∶Mn2+（30∶1）；4為K+：Mg2+（10∶3）；5為K+∶Mn2+（10∶1）；6為Na+∶Mg2+：Mn2+（30∶3∶1）；7為K+：Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）。

由圖3可以看出，選擇7號金屬離子時，獲得最大抑菌性（產量），即K+∶Mg2+∶Mn2+為10∶3∶1。

2.2.4 不同生長因子對抑菌性的影響

用不同生長因子代替原組分（總量3 mL/L），結果如圖4所示。

圖4 不同生長因子對抑菌物質抑菌性的影響

由圖4可以看出，添加乙醇作為生長因子獲得的抑菌物質的抑菌性遠高于其他生長因子，因此選擇生長因子為乙醇。

2.2.5 正交試驗設計優化各組分最佳用量

采用L9（34）正交表，以蔗糖（A）、蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏=2∶1∶1（B）、K+∶Mg2+∶Mn2+=10∶3∶1（C）、乙醇（D）作為4個考察因素，選取3個水平進行試驗。各因素及水平如表3所示；數據結果如表4所示。

表3 正交實驗因素水平

表4 實驗設計及數據結果

對實驗結果進行顯著性分析，結果如表5所示。

表4的極差分析表明，RA＞RB＞RD＞RC。由表5可知，碳源（A）、氮源（B）對抑菌結果有顯著影響（Sig.＜0.05），其中碳源（A）對抑菌性有極顯著影響（Sig.＜0.01）。試驗數據方差R2=0.986，表明結果可信度較高。4個因素對抑菌物質抑菌性影響大小為：碳源（A）〉氮源（B）〉生長因子（D）〉金屬離子（C）。在實驗設計范圍內，優化得到培養基組分的最佳值為A3B1C2D2，即蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L。用此優化培養基進行培養，所得抑菌物質濃縮液的抑菌圈直徑為32.68 mm，比用優化前培養基培養時（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

表5 顯著性分析結果

3 結論

本研究從內蒙古當地傳統發酵食品中分離出一株具有較強抑酵母菌活性的乳桿菌ALAC-3，在選擇較優培養基的基礎上，采用單因素和正交實驗法研究碳源、氮源、金屬離子、生長因子對菌株產抑菌物質的影響。確定了最適宜ALAC-3代謝產生抑酵母活性物質的培養基組分為：蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶

酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L；為下一步抑菌物質的分離純化及結構鑒定奠定了基礎。

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Medium optimization of antiyeast active substances produced by Lactobacillus ALAC-3

ZHENG Zhongwen,LI Xiaoting,LIU Jing,GAO Hechen,LI Haixuan,ZHAO Jie,CHEN Zhongjun
(Inner Mongolia Agricultural University,College of Food Science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The inhibiting activity of antiyeast substances produced by Lactobacillus ALAC-3,one strain isolated from traditional dairy fermen?tation food in Inner Mongolia was studied.In this study,one best was singled out of eight culture media that suited ALAC-3 to grow and produce antiyeast active substances.Then the best components and its volume range were confirmed by Single-Factor experiments and Or?thogonal experimental design.Experimental results indicated that the carbon source,nitrogen source significantly affected the inhibiting activi?ty on yeast.When the parameters were composed as follows:25 g/L of sucrose,20 g/L of peptone∶beef extract∶yeast extract(2∶1∶1),0.1 mol/L of K+-Mg2+-Mn2+（10∶3∶1）,2 mL/L of ethanol as growth factor,the inhibiting activity was maximum with verified value of 32.68 mm,increased by 9.3%from the initial value of 29.91 mm.

Lactobacillus;inhibiting yeast function;medium;optimization

TQ935

：A

：1001-2230（2017）07-0023-04

2016-11-25

內蒙古自然基金（2015MS0364）；國家自然基金(31260390)。

鄭中文（1990-），男，碩士，研究方向為食品微生物。

陳忠軍