細胞塊免疫細胞化學方法在非小細胞肺癌靶向治療中意義的研究

張功亮，彭芳，王建，郭廣秀，王志

(贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000)

·實驗研究·

細胞塊免疫細胞化學方法在非小細胞肺癌靶向治療中意義的研究

張功亮，彭芳，王建，郭廣秀，王志

(贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000)

目的為病人進行靶向治療提供準確可靠、方便快捷檢測方法。方法收集非小細胞肺癌患者細針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例。用細針吸取標本、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心標本制作細胞塊、HE染色和免疫細胞化學方法檢測標本中的EGFR和ALK表達情況。結果40例細胞塊免疫細胞化學結果：EGFR陽性15例（陽性率37.5%）；ALK陽性3例（陽性率7.5%）。結論細胞學可制備高質量的細胞塊，能夠為病人進行靶向治療提供準確可靠、方便快捷檢測方法。

細胞塊；免疫細胞化學；肺癌；靶向治療

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，死亡率居惡性腫瘤之首。我國肺癌發病率呈現逐年上升趨勢。近年來，隨著基因組學、蛋白組學的發展和大量靶向藥物的研究和應用，肺癌的治療已經從傳統的標準化手術治療模式走上了以基因為導向的個體化治療之路[1]。

目前單純的組織分型已不能滿足肺癌個體化治療的需求，隨著生物技術的發展，對不同組織亞型的肺癌再進行EGFR和ALK蛋白的檢測，根據肺癌驅動基因突變譜指導靶向個體化治療已經成為了現實[2-5]。

肺癌病人，特別是晚期病人無法對原發灶進行活檢，多以淋巴結轉移、遠處轉移或胸腹水為表現的，我們通過細針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心細胞塊免疫細胞化學方法檢測EGFR和ALK，為病人進行靶向治療指標的病人提供準確可靠、方便快捷檢測指導靶向用藥[6]。

我們收集我院非小細胞肺癌患者細針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例。用細針吸取標本、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心標本制作細胞塊、HE染色和免疫細胞化學方法檢測標本中的EGFR和ALK表達情況。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集贛州市人民醫院醫院病理科2014年7月-2015年12月間，在我院非小細胞肺癌患者細針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水病例40例。患者男性28例，女性12例，年齡41~77歲，平均年齡62歲，所有病例均無放療、化療病史。

1.2 細胞塊的制備臨床懷疑淋巴結轉移性肺癌的患者，穿刺前應詳細詢問病史，仔細檢查腫物位置，大小，硬度，活動度。穿刺時用左手固定腫物，右手持10ml注射器刺入腫物，保持針管內負壓，快速提插10~30余次，以針尖斜面利刃對病變多次切割，并同時借助針管內的持續負壓將切割獲得的標本吸入針芯和針管內，當看到針芯有乳向色或血性成分抽出時既拔針，直接涂片2張，瑞氏染色作細胞學診斷[7-12]。

電子支氣管鏡刷檢液和胸水，靜置30min，倒去上清，取15ml液體離心，將沉渣涂片2張，瑞氏染色作細胞學診斷。

細胞塊制作：⑴標本移出：借助空氣壓力將針管內的穿刺標本噴至載璃片上。⑵乙醇固定：用穿刺針將載玻片上的標本聚集成一小團，吸除多余的血液，將標本放置2~5min，然后連同載玻片浸入95%的乙醇中2min。再用穿刺針將載玻片上標本聚集成更小的團塊，再次浸入95%的乙醇中2min，注意觀察制做的團塊應與載班片緊密連接，不從載玻片滑脫。⑶甲醛固定：將已經凝固在載玻片上的標本塊移至盛有中性甲醛的固定液的器皿中固定2h。⑷用手術刀片水平角度從載玻片上切下、平移已經固定好的細胞塊，至普通包埋盒和正常組織一樣完成脫水和蠟過程。對細胞塊進行石蠟包埋，連續切片，厚3～5μm，行常規HE染色和免疫組化標記。

1.3 免疫細胞化學方法免疫細胞化學試劑一抗采用福州邁新生物技術開發公司生產的EGFR和ALK。檢測系統采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細胞塊石蠟切片厚度3～4μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照

1.4 結果判定免疫細胞化學判斷的標準：定位準確，有棕黃色顆粒判讀為陽性，EGFR陽性定位于細胞漿或細胞膜，ALK陽性定位于細胞質核旁：腫瘤細胞核陽性細胞數的比例＜10%為陰性，＞10%為陽性，結果判定采用雙盲對照法觀察。

2 結果

穿刺細胞學制作細胞塊和電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心后制作細胞塊檢查獲取的細胞量較多，并含有微小顆粒，保留部分組織結構，可制備高質量的細胞塊(圖1)，有助于做出細胞病理診斷。免疫細胞化學方法顯示細胞分布較均勻，陽性著色部位準確，背景清晰（圖2）。40例細胞塊免疫細胞化學結果：EGFR陽性15例（陽性率37.5%）；ALK陽性3例（陽性率7.5%）。

圖1 細胞塊HE染色×200

圖2 細胞塊免疫細胞化學EGFR×400

3 討論

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，為cerbB(HER)家族中4個成員之一。非小細胞肺癌中EGFR突變率在在亞裔、女性、非吸煙、腺癌中EGFR突變率最高。針對EGFR的小分子酪氨酸激酶吉非替尼、厄洛替尼及埃克替尼。其有效性主要表現在對外顯子19缺失或外顯子2l L858R突變的肺腺癌治療中[1，13，14]。

ALK位于2號染色體短臂發生異位重排，與EML4基因融合，形成具有癌基因屬性的EML4-ALK，約有4%的非小細胞肺癌患者EML4-ALK融合基因陽性。患者多為年輕、男性、不吸煙或少量吸煙腺癌患者。目前針對該靶點的藥物有Crizotini。

肺癌病人，特別是晚期病人無法對原發灶進行活檢，多以淋巴結轉移、遠處轉移或胸腹水為表現的，我們通過細針穿刺、電子支氣管鏡刷檢液和胸水離心細胞塊免疫細胞化學方法檢測EGFR和ALK，為進行靶向治療的病人提供準確可靠、方便快捷檢測指標指導靶向用藥[15]。

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R446.8，R734.2

A

1674-1129(2017)04-0479-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.007

2017-02-22；

2017-05-29)

張功亮，男，1960年生，副主任醫師，從事病理診斷工作。

彭芳，女，1985年生，主治醫師，碩士研究生，病理與病理生理學專業。