ABI7500 HBV-DNA檢測系統性能評價

胥明勇，朱華強

(綿陽市中心醫院，四川綿陽621000)

ABI7500 HBV-DNA檢測系統性能評價

胥明勇，朱華強

(綿陽市中心醫院，四川綿陽621000)

目的對ABI7500 HBV-DNA檢測系統進行性能評價，確定該系統是否穩定可靠。方法按照美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical Laboratory and Standards Institute，CLSI)系列文件，對ABI7500 HBV-DNA檢測系統的精密度、正確度及線性指標進行評價；根據HBV-DNA標準品的陽性檢出率判斷該檢測系統的最低檢出限。結果ABI7500 HBV-DNA檢測系統的批內精密度（s批內）分別為0.08和0.06；批間精密度（s批間）分別為0.06和0.12；正確度符合要求；線性分析通過驗證實驗；最低檢出限為1.00×102IU/ml。結論ABI7500 HBV-DNA檢測系統的精密度、正確度、線性、最低檢出限性能評價均能滿足臨床檢測要求。

精密度；線性；性能評價；乙型肝炎病毒DNA

HBV-DNA定量檢測是乙肝抗病毒治療重要療效監測指標[1]，而測定結果會直接影響患者的治療方案[2]，因此儀器性能指標只有符合要求時，才能將該儀器用于臨床樣本檢測[3]。依據美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)系列文件的內容和方法，結合所使用HBV-DNA試劑盒產品性能要求，對我科新購的ABI7500實時熒光定量PCR儀定量測定HBV-DNA，對該檢測系統進行性能評價。

1 材料與方法

1.1 材料臨床標本來源于我院住院患者。HBV DNA濃度為低值、高值的樣本各收集10例，標本性狀要求無溶血、黃疸、脂血，經檢測HBV DNA濃度分別為1.20×104IU/ml、4.20×107IU/ml，分裝在已滅菌的0.5ml EP管內，置于-20℃冰箱保存備用；HBV DNA濃度范圍為4.00×104～4.00×107IU/ml的標準品由湖南圣湘生物科技股份有限公司提供。

1.2 主要儀器和試劑ABI7500實時熒光定量PCR儀（美國）；HBV-DNA熒光定量PCR檢測試劑盒（湖南圣湘）。

1.3 方法參照CLSI的EPl5-A2[4]、EP6-A[5]文件推薦的方法進行以下項目的評價。

1.3.1 精密度評價對HBV DNA為2個濃度標本，用ABI7500實時熒光定量PCR儀每天分析一批，重復測定3次，連續測定5d。每天室內質控在控后，記錄實驗數據，實驗完成后計算批內精密度、批間精密度，與CLIA’88推薦的允許總誤差作比較：⑴批內精密度：標準差應小于或等于室間質評允許總誤差的1/4；⑵批間精密度：標準差應小于或等于室間質評允許總誤差的1/3，判斷其精密度是否可接受(本次實驗采用了衛生部臨檢中心制定的HBV-DNA定量室間質評標準為靶值±0.4IU/ ml，數據經對數轉換）。

1.3.2 正確度評價按照參考物質評價準確度方案，使用國家衛計委臨檢中心發放的2016年全年室間質評陽性樣本作為參考物質(此次質評成績已回報，并知質評標準)，用ABI7500實時熒光定量PCR儀對5個陽性樣本每天分析一批，重復測定3次，連續測定5d，計算2個不同水平的質評樣本均值，按照衛生部臨檢中心制定的HBV DNA定量室間質評標準為靶值±0.4IU/ml(數據經對數轉換)的要求，判斷測定結果是否在允許的范圍內。

1.3.3 線性范圍評價⑴用陰性血清將濃度5.00× 108IU/ml樣本梯度稀釋成7個樣本，濃度分別為5.00×108、5.00×107、5.00×106、5.00×105、5.00×104、5.00×103、5.00×102IU/ml。每種濃度的樣本重復測定4次，檢查重復測定數據有無離群值，以及不精密度是否符合要求。對7個稀釋系列樣本的實驗數據進行多項式回歸分析處理，分別對二階（b2）回歸系數及三階（b2，b3）回歸系數作t檢驗，P＞0.05，表明三個回歸系數都無統計學意義，判斷為一級線性，則該檢測系統的線性范圍驗證通過。⑵將7個濃度梯度樣品設置為標準品（按科學計數法設置理論濃度值），進行標準曲線線性分析，得出線性回歸y=a+bx，通過的標準為：相關系數R2≥0.98，a在43~46內，b在-3.2~-3.6內。

1.3.4 最低定量檢出限評價將HBV-DNA濃度為4.00×104IU/m的標準品作為基礎樣本，用陰性血清進行梯度稀釋，稀釋后的樣本濃度分別為4.00× 103、4.00×102、1.00×102、4.00×101IU/ml，每個濃度標準品分別在ABI7500熒光定量PCR儀上檢測20次，計算各濃度CV%，以陽性檢出率為100%的最低濃度為判斷標準（陽性標本判斷標準為有明顯S型擴增曲線且Ct＜38，內標檢測為陽性且Ct＜40）。1.4統計學處理計量資料經對數轉換后，采用SPSS 19.0統計軟件包對多項式回歸分析給出的二階和三階方程的回歸系數作t檢驗，P＜0.05有統計學意義。

表1 ABI7500測定HBV DNA精密度結果

表2 ABI7500測定HBV DNA正確度結果

2 結果

2.1 精密度評價結果2個濃度標本的批內精密度的標準差均小于0.1(即1/4室間質評允許總誤差)，批間精密度的標準差均小于0.13(即1/3室間質評允許總誤差)，精密度評價通過。見表1。

2.2 正確度評價結果檢測2016年全年室間質評陽性樣本，測定均值的對數值均在評價允許范圍內，正確度評價通過。見表2。

2.3 線性范圍評價結果

2.3.1 HBV-DNA的二階回歸系數b2為-0.010，三階回歸系數b2為0.000，三階回歸系數b3為-0.001，對回歸系數作t檢驗，P＞0.05，三個回歸系數都無統計學意義，判斷為一級線性，則該儀器線性分析驗證通過。

2.3.2 標準曲線線性分析得出線性回歸y=-3.204x+43.049，R2=0.999，各項指標均通過，標準曲線線性圖如圖1。

圖1 標準曲線線性圖

2.3.3 線性范圍為500-5.00×108IU/ml驗證通過。

2.4 最低定量檢出限評價結果HBV-DNA濃度大于或等于1.00×102IU/ml的稀釋樣本檢出率為100%，其CV%均小于5%，在試劑廠家所要求的范圍內。標準品濃度為4.00×101IU/ml的陽性檢出率為42%，判斷該檢測系統最低檢出限為1.00×102IU/ ml。

3 討論

檢測系統的分析性能能夠滿足臨床要求是醫學實驗室認可和“檢驗結果互認”的根本保證[6]，也是臨床實驗室全面質量控制所需。對于新購進的儀器及其檢測系統，在正式用于檢測患者標本，發出檢驗報告前，要求實驗室對系統的各項分析性能進行驗證。CNAS-CL36要求在分子診斷領域性能驗證內容至少應包括正確度、精密度、線性、最低檢出限等內容，但目前沒有具體的評價方法，因此，在分子生物實驗室，檢驗系統性能的評價主要參考CLSI的系列標準文件。

目前國內普遍使用精密度評價方案基本是EP5-A2、EP15-A2[7]，EP5-A2適用于制造商對儀器性能的建立、確認及核實，而EP15-A2是專門針對用戶評價檢測系統而制定的，該方案因為評價時間較長，從而才能真實地反映儀器工作性能狀態[8]因此精密度評價參照了EP15-A2文件。2個濃度水平樣本的標準差均在CLIA’88推薦的允許總誤差內，2個濃度水平樣本的CV值均在試劑廠家所要求的范圍內，精密度評價通過。但通過結果分析，2個濃度水平樣本的批內精密度基本一致，而批間精密度相差一倍，這種差異可能與實驗方法學敏感性高有關。在重復性良好的情況下才能進行其他實驗[9]，因此要求精密度評價通過了，才能進行其它分析性能進行驗證。

EP15-A2文件給出了正確度兩種驗證方案。其一方案是用新方法與比對方法同時檢測患者標本，其二種是使用參考物質，可以是國際或國家標準物質、室間質評物質等。本次評價試驗采用的是國家衛計委臨檢中心發放的室間質評物作為參考物質評價方案，此次評價的檢測均值均在允許范圍內。此次評價的陽性樣本只有低、中值2個濃度樣本，沒有涉及高值濃度樣本，這是在正確度評價方面的不足。線性評價采用了EP6-A文件，該評價方案對于臨床實驗室工作人員更適用[10]。EP6-A法基于多項式回歸理論，是目前判斷線性的最佳方法[11]。在線性范圍評價中，加入了標準曲線線性分析，其反映了樣品的CT值（臨界循環數）與樣品濃度的理論值也符合線性關系，這種線性驗證針對具體檢驗方法，在實際工作中是可行的。制造商提供定量線性范圍為500~5.00×109IU/ml，本次實驗暫無最高濃度為5.00×109IU/ml的樣本，待能收集到此濃度的樣本再進行線性驗證。最低檢出限是選擇一低值樣本稀釋至試劑說明書給出的檢出限接近的濃度[12]，以陽性檢出率為100%的最低HBV-DNA標準品濃度，且CV%均小于5%，才能判斷該檢測系統最低檢出限為1.00×102IU/ml。ABI7500 HBV-DNA檢測系統與方莉等[13]提到的Roche 480檢測系統相比，其最低檢出限有所提高，表明該系統提高了臨床樣本的陽性檢出率。

經實驗證明，ABI7500 HBV-DNA檢測系統的精密度、正確度、線性、最低檢出限符合要求，能夠用于臨床樣本檢測。

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Performance Evaluation of ABI7500 HBV-DNA Detecting System

XU Mingyong，ZHU Huaqiang.Clinical Laboratory，Mianyang Central Hospital，Mianyang Sichuan 621000，China.

Objective To evaluate the performance of ABI7500 HBV-DNA detecting system confirmed its stability and reliability.Methods According to the evaluation protocols of Clinical Laboratory and Standards Institute(CLSI)，the performance of the ABI7500 HBV-DNA detecting system was assessed by the parameters of precision，accuracy and linearity；the minimum detection limit validation experiments were performed by detecting the positive rate of HBV-DNA standard substance.Results The standard deviation within-run precision of this detecting system was 0.08 and 0.06 respectively，and the between-run precision was 0.06 and 0.12，respectively.Its accuracy was within acceptable range，and linear analysis was tested by experiment.The minimum detection limit was 1.00×102IU/ml.ConclusionPerformance of the precision，trueness，linearity and minimum detection limit of ABI7500 HBV-DNA detecting system meets the requirement of clinical detection.

∶Precision；Linearity；Performance evaluation；HBV-DNA

R512.6+2，R446.62

A

1674-1129(2017)04-0489-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.011

2016-11-22；

2017-05-01)

胥明勇，男，1972年生，主管技師，主要從事臨床分子生物學，Tel：0816-2247036，E-mail：xmy1972@126.com。