乳腺癌細胞塊免疫細胞化學和熒光原位雜交(FISH)法HER-2檢測對比研究

彭芳，王建，張功亮，鐘斌

(1、贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西贛州341000)

乳腺癌細胞塊免疫細胞化學和熒光原位雜交(FISH)法HER-2檢測對比研究

彭芳1，王建1，張功亮1，鐘斌2

(1、贛州市人民醫院病理科，江西贛州341000；2、贛南醫學院第一附屬醫院藥劑科，江西贛州341000)

目的研究乳腺癌細針穿刺細胞蠟塊采用免疫細胞化學的方法檢測HER-2蛋白，并用FISH方法檢測該方法的準確性。方法對40例乳腺癌患者進行細針穿刺細胞學檢測，并用免疫細胞化學方法檢測HER-2蛋白表達情況，并與術后腫塊切除或者粗針穿刺標本FISH方法檢測HER-2基因狀態的結果進行對比統計，以此探討乳腺癌免疫細胞化學檢測HER-2蛋白表達情況的意義。結果40例細胞塊HER-2免疫細胞化學結果：3+有3例，2+有2例，1+有4例，陰性31例。FISH檢測結果：HER-2免疫細胞化學3+的3例，HER-2基因均有擴增；HER-2免疫細胞化學2+的2例，其中1例HER-2基因有擴增；HER-2免疫細胞化學1+的4例，HER-2基因無擴增。結論本實驗應用用乳腺癌穿刺細胞塊用免疫細胞化學檢測HER-2蛋白的表達情況，并和手術標本做FISH檢測HER-2基因擴增狀態進行對比，證實免疫細胞化學檢測HER-2結果有較高的準確性。

乳腺癌；細胞塊；免疫細胞化學；熒光原位雜交；HER-2

乳腺癌病人大約有25%左右有HER-2/neu基因的擴增和/或過度表達[1]。乳腺癌細胞中HER-2/ neu基因的擴增常預示著患者預后較差。應用單克隆抗體赫賽汀治療HER-2/neu基因有擴增乳腺癌患者，即乳腺癌靶向治療[1，2]，有比較肯定的療效。熒光原位雜交技術（FISH）是檢測乳腺癌患者的HER-2/neu基因狀態的金標準[3-5]。

本文探討用乳腺癌細針穿刺標本制作細胞蠟塊的標本，用免疫細胞化學的方法檢測HER-2蛋白的可行性，并用FISH方法檢測該方法的準確性。

我們對40例乳腺癌患者進行細針穿刺細胞學檢測，并用免疫細胞化學方法檢測HER-2蛋白表達情況，并與術后腫塊切除或者粗針穿刺標本FISH方法檢測HER-2基因狀態的結果進行對比統計，以此探討乳腺癌免疫細胞化學檢測HER-2蛋白表達情況的意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料選擇2013年1月至2015年1月，我院有手術病理學結果并在術前做細針穿刺細胞學檢查，并制作細胞塊的乳腺癌患者40例。患者均為女性，年齡26~77歲，平均年齡44歲，左側病灶28例，右側病灶12例，腫物最大徑0.6cm~7cm。選擇的所有病例術前無化療、放療等治療病史。

1.2 制備細胞塊對乳腺腫塊的患者，穿刺前確定腫物位置、大小、硬度、活動度和邊界，消毒，固定腫物，用10ml普通注射器穿刺，刺入腫物后，保持負壓，通過快速抽提對腫物進行反復切割，同時借助針管內的負壓將標本吸入穿刺針內，涂片2張，做瑞氏染色細胞學檢查。剩余標本直接打在玻片上并聚攏，滴2次95%的酒精覆蓋組織自然風干，然后將玻片和其上的組織直接放入10%的中性福爾馬林中固定，然后常規包埋、制片。

1.3 免疫細胞化學方法免疫細胞化學試劑一抗采用福州邁新生物技術開發公司生產的HER-2。檢測系統也采用福建邁新公司的Elivision試劑盒。細胞塊石蠟切片厚度3μm，60℃烤箱烤片1h，梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，蒸餾水浸泡5min，3%過氧化氫室溫孵育10min阻斷內源性過氧化酶的活性，PBS液沖洗，高壓鍋抗原修復，自然冷卻至室溫。加入二步法Elivision試劑盒中試劑A，室溫孵育20min，PBS沖洗3次，每次5min，加入試劑盒中試劑B，室溫下孵育30min，PBS沖洗3次，每次5min。鏡下控制DAB顯色，蒸餾水沖洗終止反應。蘇木素復染，鹽酸酒精分化，自來水沖洗返藍，脫水，透明，中性樹膠封片，每次均做陽性對照及PBS代替一抗做陰性對照。

1.4 FISH檢測⑴檢測試劑盒：石蠟預處理Ⅱ試劑盒。其中主要含有的預處理溶液和蛋白酶緩沖液、PathVysion HER-2探針試劑盒購自Vysis公司。⑵標本處理：石蠟切片于56℃烤片過夜。常規脫蠟，在預處理溶液中，80℃處理10min，再于蛋白酶溶液中消化15min，梯度乙醇脫水后，自然干燥。⑶FISH：取10μl探針混合液滴于經過上述處理的組織標本上，蓋上蓋玻片，橡膠水泥封片。將標本放在雜交儀中，73℃變性5min后，37℃雜交過夜。次日取出標本，去掉橡膠水泥，在洗脫液(2×SSC/0．3% NP40)中，73℃洗滌2min，再于室溫下在洗脫液中洗滌5s，自然干燥。二脒基苯基吲哚(DAPI)對比染色，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 結果判定⑴HER-2免疫細胞化學判斷的標準：定位準確，定位于細胞膜，陰性：未觀察到染色或≤10%腫瘤細胞出現不完整、微弱或難以察覺的細胞膜染色。＞10%腫瘤細胞出現不完整、微弱或難以察覺的細胞膜染色為（1+）。＞10%腫瘤細胞出現不完整和(或)微弱／中度細胞膜染色或≤10%腫瘤細胞出現完整的細胞膜強陽性染色為（2+）。＞10%腫瘤細胞出現完整的細胞膜強染色為（3+）。⑵FISH判讀標準：計數細胞核內紅色的HER-2基因熒光信號和17號染色體的綠色熒光信號的數目比值，即Ratio值(Ratio=30個細胞核中紅色信號總數/30個細胞核中綠色信號的總數)。Ratio值＜2為，且平均HER-2拷貝數/細胞＜4時為陰性，提示無基因擴增；Ratio值≥2或Ratio值＜2且平均HER-2拷貝數/細胞＞6，時為HER-2基因擴增；若Ratio值＜2且平均HER-2拷貝數/細胞≥4且＜6，則視為不確定，需要再計數30個細胞核中的信號或由另外一個分析者重新計數，或選取不同組織塊重新檢測。

1.6 統計學方法數據用SPSS 16．0統計學軟件進行分析。采用Kappa值分析兩種檢測方法的一致性，所有檢驗取雙側檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

40例細胞塊HER-2免疫細胞化學結果：3+有3例，2+有2例，1+有4例，陰性31例。FISH檢測結果：HER-2免疫細胞化學3+的3例，HER-2基因均有擴增；HER-2免疫細胞化學2+的2例，其中1例HER-2基因有擴增；HER-2免疫細胞化學1+的4例，HER-2基因無擴增。見圖1～3。

圖1 細胞塊HE染色×200

圖2 細胞塊免疫細胞化學HER-2×400

圖3 細胞塊HER-2基因擴增（FISH法×1000）

3 討論

HER-2基因，是表皮生長因子受體(EGFR)家族成員之一，它位于染色體17q12-21．32，編碼1255個具有跨膜酪氨酸激酶活性的蛋白[1-5]，分子量約為185kD。HER-2陽性的乳腺癌患者預后不良，與腫瘤的復發和轉移相關。用石蠟包埋的組織塊或細胞塊標本，檢測基因HER-2基因拷貝數來評價它的DNA水平，是目前HER-2基因檢測的金標準[6-9]。

我們用細針穿刺乳腺癌組織制備的細胞塊標本，通常含有微小組織或顆粒，保留了部分組織結構特點，并且細胞采集量多，分布適中。該技術最大特點是可以連續切片免疫細胞化學檢測和FISH檢測等[10-13]。而且利用細胞塊標本進行免疫細胞化學染色效果佳，本實驗和術后腫塊切除或者粗針穿刺標本FISH方法檢測HER-2基因狀態的結果進行對比研究，發現免疫細胞化學檢測HER-2（3+）的3例病例FISH檢測HER-2結果均為陽性，HER-2（2+）2例，其中1例HER-2基因有擴增，符合率為80%。而手術切除標本免疫組織化學檢測HER-2(2+)和（3+）的病例與FISH檢測HER-2基因狀態陽性符合率為78.2%。可見應用細胞塊免疫細胞化學方法檢測HER-2蛋白表達情況有較高的準確性[10]。但是仍有部分HER-2蛋白檢測結果2+甚至3+的病例FISH檢測HER-2基因無擴增，根據國內外文獻報道[8-14]可能是由于17號染色體為多體導致HER-2蛋白檢測假陽性的結果。

實驗操作應該注意，穿刺細胞塊標本應注意經過及時并且充分的10%福爾馬林固定，因為標本離體超過1h或者固定時間不充分會影響HER-2的免疫細胞化學檢測和FISH檢測結果。

準確的HER-2檢測結果可以較好的指導患者治療，并對預后進行較好的評價，避免對HER-2陰性的患者不必要的治療造成不必要的傷害。

本實驗應用用乳腺癌穿刺細胞塊用免疫細胞化學檢測HER-2蛋白的表達情況，并和手術標本做FISH檢測HER-2基因擴增狀態進行對比，證實免疫細胞化學檢測HER-2結果有較高的準確性。

這樣對一些無法進行手術切除或者粗針穿刺的病人來說可以根據細針穿刺的結果進行靶向治療，可以免去病人腫塊局部切除或粗針穿刺的痛苦，減少出血和感染的風險，對乳腺癌病人的治療和預后評估有重要意義[13，14]。

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R446.8，R737.9

A

1674-1129(2017)04-0529-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.026

2016-09-26；

2017-03-13)

鐘斌