三種實驗室檢測方法在瘧疾檢測中的應用比較

施勇，龔甜，李健雄，肖芳，周珺，熊英

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

三種實驗室檢測方法在瘧疾檢測中的應用比較

施勇，龔甜，李健雄，肖芳，周珺，熊英

(江西省疾病預防控制中心，江西南昌330029)

目的探討三種實驗室檢測方法對瘧疾檢測的應用價值。方法分別采用傳統鏡檢法、巢式聚合酶鏈反應（PCR）法及實時熒光（Real-Time）PCR法，對江西省2012年-2014年的61份瘧疾疑似病例血樣進行檢測。結果巢式PCR法和Real-Time PCR法的結果一致，與鏡檢結果有17份樣本不一致。結論巢式PCR法和Real-Time PCR法檢測瘧疾感染具高度敏感性和特異性，對瘧疾鑒別診斷和明確診斷具有重要價值。

瘧疾；巢式聚合酶鏈反應；鏡檢法

瘧疾是經蚊媒傳播的重要熱帶病，也是嚴重危害人類身體健康和生命安全及社會經濟發展的重要寄生蟲病[1]，主要流行于熱帶和亞熱帶地區。在目前瘧疾防治和監測工作中，鏡檢仍為發現瘧疾病例的主要手段[2]，但傳統的鏡檢方法檢出率低并費時、費力，且鏡檢人員的專業素質和經驗會直接影響結果的判定，當原蟲密度較低時，鏡檢容易出現漏檢，對于國內少見的卵形瘧和三日瘧，容易錯判。近年來國內外將巢式PCR和Real-Time PCR技術應用于瘧疾的快速檢測和分型[3]，能準確判斷疑似病例是否感染或攜帶瘧原蟲，以便及時發現和采取必要的防控措施。

本研究采用姬氏染色鏡檢、巢氏PCR及實時熒光（Real-Time）PCR法3種方法對江西省2012年-2014年各地市疾控中心上送的61份瘧疾疑似病例血樣進行檢測，并對結果進行分析，比較其優缺點。

1 材料與方法

1.1 瘧疾樣本江西省2012年-2014年各地市疾控中心上送的61份瘧疾疑似病例血樣。

1.2 儀器和試劑核酸提取試劑盒（QIAamp DNA Mini Kit）購自德國Qiagen公司；PCR Master Mix (LOT.0000031171)購自美國Promega公司；光學顯微鏡購自日本Olympus公司，循環擴增儀購自美國Bio-rad公司，凝膠成像系統購自法國VILBER LOURMAT公司，熒光PCR儀為ABI7500。

1.3 顯微鏡檢查以姬氏染色法染色厚薄血片，參照中華人民共和國衛生行業標準-瘧疾診斷標準（WS259-2015）附錄B《病原學檢查》規范要求，進行厚薄血膜制作與吉氏染色，顯微鏡油鏡下檢查。

1.4 巢氏PCR檢測用QIAamp DNA Mini Kit核酸提取試劑盒提取濾紙血中的瘧原蟲基因組DNA，按說明書操作，獲得100μl DNA，－70℃保存。對核酸進行巢氏PCR擴增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見表1。反應體系（25μl）：2×PCR Master Mix 12.5μl，上、下游引物（10μmol/ μl）各1μl，模板DNA 5μl（第1輪），用ddH2O補至25μl。反應條件：94℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃1min 40s，共35個循環；72℃10min。取第一輪PCR產物1μl為模板DNA進行第二輪PCR，反應體系和反應條件同上。以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定第二輪PCR產物，用凝膠成像系統觀察結果。

1.5 實時熒光（Real-Time）PCR檢測用上海之江的商品化試劑盒按照說明書進行檢測，試劑盒分別為瘧原蟲核酸測定試劑盒（貨號ED-0066-02），惡性瘧核酸測定試劑盒（貨號ED-0214-02），卵形瘧核酸測定試劑盒（貨號ED-0215-02），三日瘧核酸測定試劑盒（貨號ED-0216-02），間日瘧核酸測定試劑盒（貨號ED-0217-02），卵形瘧原蟲Wallikeri亞種核酸測定試劑盒（貨號ED-0425-02）。

2 結果

比較、分析61份樣品的檢測結果，61份樣品為2012年-2014年各地市疾控中心采集并鏡檢陽性樣本，上送至省疾控中心，均為輸入性瘧疾病例，其鏡檢結果為44份惡性瘧，13份間日瘧，4份瘧疾未分型。而巢式PCR法和Real-Time PCR法的結果一致，其結果為44份惡性瘧，6份間日瘧，1份卵形瘧，1份三日瘧，2份惡性瘧和三日瘧混合感染，其余7份陰性。PCR檢測結果與鏡檢結果有44份一致，其中惡性瘧39份，間日瘧5份；有17份樣本與鏡檢結果不一致（表2）。

表1 巢氏PCR檢測瘧原蟲種類的引物及其擴增產物長度

表2 61份樣本鏡檢法與巢式PCR法和Real-Time PCR法結果比較

3 討論

瘧疾診斷標準（WS259-2015）中規定的三種實驗室檢查中，以形態學為基礎的血涂片顯微鏡檢查，是多數基層醫療單位主要或唯一的診斷手段，其敏感度可達到血樣10～20個原蟲/μl[4]。該方法簡便、經濟，適用于基層應用；缺點是結果判讀受檢驗人員鏡檢技術、制片染色技術、顯微鏡質量和視力疲勞程度等因素影響，導致瘧疾病例的確診與鑒別診斷困難[5]。特別在瘧原蟲混合感染或藥物治療后，瘧原蟲形態遭到破壞，給原蟲染色鏡檢增加非常大的難度[6]，而以分子形式存在血液中的核酸不受破壞，仍可被檢出。本研究中，經過巢式PCR法和Real-Time PCR法的復核檢測，鏡檢有5份惡性瘧和8份間日瘧發生了誤診，對瘧疾病例的治療帶來了一定的影響。

PCR檢測是通過體外擴增，使得特異性靶DNA序列拷貝數在數小時內成百萬倍的增加，大大提高了檢測的敏感性。檢測間日瘧和惡性瘧的敏感度血樣分別為0.1個原蟲/μl[7]和1.5個原蟲/ μl[8]，顯著高于其他檢查方法。而且PCR檢測瘧疾具有瘧原蟲種、株的鑒別能力，并能方便地檢測出鏡檢漏診的混合感染。近年來，許多學者用PCR技術檢測瘧原蟲的實驗室研究中，均顯示了PCR在瘧疾診斷中比鏡檢檢測方法更具敏感性及特異性[9-11]。本研究中，巢式PCR法和Real-Time PCR法檢出了鏡檢漏檢的2例混合感染的病例，并對鏡檢未能分型的4份瘧疾病例進行了分型，其中1份惡性瘧，1份三日瘧，2份陰性，由于不同型別的瘧疾治療藥物有所不同，瘧疾病例正確的分型對于治療來說意義重大。

由于人群對瘧疾抵抗力的增強，加上抗瘧藥的濫用，病人治療不規范等，使傳染源多為低密度帶蟲者。常規鏡檢法不易檢出，常出現漏診，使傳染源不能及時發現和徹底根除。因此，PCR作為高度敏感、高度特異的瘧疾診斷技術，更能適應瘧疾監測、診斷和鑒別診斷的需要[12]，并為下一步的治療提供最正確的科學依據。隨著PCR技術的日趨成熟和檢測成本的降低，在瘧疾防治、監測中，將具有廣闊的應用價值和前景。

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R531.3，R446.11+1，R446.62

A

1674-1129(2017)04-0545-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.04.032

2016-09-19；

2017-06-12)