抗性和敏感生物型菵草代謝精唑禾草靈的速度差異

顏欣茹+楊俊雪+薛君+劉嘉慧+李凌緒

摘要：為了測(cè)定菵草抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12對(duì)精唑禾草靈代謝速度的差異，建立了精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮的高效液相色譜（HPLC）分析方法。結(jié)果表明，在0.123～30.000 μg/mL范圍內(nèi)、0.977～1 000.000 μg/mL范圍內(nèi)、0.469～30.000 μg/mL范圍內(nèi)6-氯苯并唑酮、精唑禾草酸、精唑禾草靈濃度與響應(yīng)值線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.991 2、0972 2、0.996 3。應(yīng)用上述方法分析發(fā)現(xiàn)，精唑禾草靈處理后2 h在菵草體內(nèi)即可檢測(cè)到精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮，藥后2～96 h抗性生物型SD-04-SS體內(nèi)精唑禾草靈的含量始終略高于敏感生物型SD-12，藥后24～72 h抗性生物型SD-04-SS體內(nèi)精唑禾草酸的含量顯著低于敏感生物型SD-12，說(shuō)明抗性生物型降解精唑禾草酸的速度比敏感生物型更快。

關(guān)鍵詞：菵草；精唑禾草靈；代謝；高效液相色譜；除草劑抗性

中圖分類號(hào)：S482.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1003-935X（2017）01-0015-05

Differences in Metabolism Rate of Fenoxaprop-P-Ethyl Among

Beckmannia syzigachne Biotypes

YAN Xinru，YANG Junxue，XUE Jun，LIU Jiahui，LI Lingxu

（Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China）

Abstract： An HPLC method was developed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in Beckmannia syzigachne，and to determine differences in the rate of fenoxaprop-P-ethyl degradation between the resistant biotype SD-04-SS and susceptible biotype SD-12. Excellent linearity was obtained in the range of 0.123-30 μg/mL，0.977-1000 μg/mL and 0.469-30 μg/mL for 6-chlorobenzoxazolone，fenoxaprop-P and fenoxaprop-P-ethyl，respectively，with correlation coefficient of 0.9912，0.9722 and 0.9963，respectively. The method was employed to analyze the concentration of fenoxaprop-P-ethyl，fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone in both biotypes. Fenoxaprop-P and 6-chlorobenzoxazolone could be detected in B. syzigachne 2 hours after treatment with fenoxaprop-P-ethyl. The concentration of fenoxaprop-P-ethyl in SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 2～96 hours after treatment （HAT），but the concentration of fenoxaprop-P in

收稿日期：2016-12-20

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31301680）；青島農(nóng)業(yè)大學(xué)2015年大學(xué)生科技創(chuàng)新基金。

作者簡(jiǎn)介：顏欣茹（1995—），女，本科生。E-mail：2323458818@qq.com。

通信作者：李凌緒，博士，副教授，主要從事雜草抗藥性研究。E-mail：lingxulipvi@126.com。SD-04-SS （R） was always higher than that in SD-12 （S） within 24～72 hours. Thefore the resistant biotype SD-04-SS degrades fenoxaprop-P faster than the susceptible biotype SD-12.

Key words： Beckmannia syzigachne；fenoxaprop-P-ethyl；metabolism；HPLC；herbicidal resistance

菵草（Beckmannia syzigachne）為禾本科菵草屬一年生雜草，是長(zhǎng)江中下游地區(qū)稻茬麥田的主要雜草之一[1-3] 。精唑禾草靈（fenoxaprop-P-ethyl）屬于乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）抑制劑類除草劑，是小麥田苗后選擇性防治禾本科雜草的主要除草劑品種之一。精唑禾草靈在禾本科雜草體內(nèi)代謝為精唑禾草酸（fenoxaprop-P）起到除草作用，精唑禾草酸進(jìn)一步代謝為6-氯苯并唑酮（6-chlorobenzoxazolone）等化合物后失去除草效果[4-5]。我國(guó)自1990年代開(kāi)始應(yīng)用精唑禾草靈防除稻茬麥田菵草，如今江蘇、安徽、山東等部分地區(qū)的菵草已對(duì)精唑禾草靈產(chǎn)生了抗性[6-9]。筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)采自山東省魚(yú)臺(tái)縣的SD-04生物型對(duì)精唑禾草靈產(chǎn)生了236.8倍抗性，克隆其ACCase序列測(cè)序比對(duì)后在其ACCase CT亞基上鑒定出了已知的抗性位點(diǎn)Gly-2 096-Ala[10]。應(yīng)用CAPS技術(shù)從SD-04生物型中分離到2 096 位等位基因野生型SD-04-SS，經(jīng)生物測(cè)定后發(fā)現(xiàn)SD-04-SS對(duì)精唑禾草靈仍然有635倍抗性[11]，可見(jiàn)SD-04-SS很可能存在對(duì)精唑禾草靈的非靶標(biāo)抗性，代謝速度差異可能是其抗性機(jī)理之一。為了明確SD-04-SS與敏感型菵草代謝精唑禾草靈的速度是否存在差異，本研究建立了分析菵草體內(nèi)精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸、6-氯苯并唑酮含量的高效液相色譜（HPLC）方法，并測(cè)定了抗性生物型菵草SD-04-SS和敏感型菵草SD-12體內(nèi)精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物精唑禾草酸的含量，以明確抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12代謝精唑禾草靈及精唑禾草酸速度的差異。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雜草：抗性生物型菵草SD-04-SS是分離自精唑禾草靈抗性生物型SD-04的等位基因野生型植株，敏感生物型SD-12采自山東省泰安市渿河公園。

供試藥劑：精唑禾草靈對(duì)照品（阿拉丁）、精唑禾草酸對(duì)照品（Dr. Ehrenstorfer GmbH）、6-氯苯并唑酮對(duì)照品（Sigma-Aldrich）、95%精唑禾草靈原藥（山東濱農(nóng)科技有限公司）、甲醇（色譜純）、超純?nèi)ルx子水，其余試劑均為分析純。

儀器：Agilent 1200型高效液相色譜儀（含VWD紫外檢測(cè)器）、手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、工作站（美國(guó)安捷倫公司）；3WP-2000型自行式噴霧塔（農(nóng)業(yè)部南京農(nóng)業(yè)機(jī)械化研究所）。

1.2 方法

1.2.1 雜草培養(yǎng)與樣品制備 菵草種子萌發(fā)參考Li等的方法[12]，待種子萌發(fā)后種入裝有壤土的塑料花盆中（直徑20cm），每盆植入8株，在溫室內(nèi)培養(yǎng)至兩葉一心期間苗，保留長(zhǎng)勢(shì)一致的5株幼苗，然后剪去地上部分，待其長(zhǎng)出新葉以增加受藥的面積。菵草重新長(zhǎng)到三葉一心期時(shí)用3WP-2000型自行式噴霧塔噴施精唑禾草靈，用量為310.5 g a.i./hm2。分別在藥劑處理后2、8、24、48、72、96、144 h剪下地上部分，稱質(zhì)量，立即在液氮中磨碎，加入3倍體積（V/m）甲醇室溫下微波振蕩提取60 min，提取液12 000 r/min離心，取上清液。上清液用氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇重新溶解定容，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，取濾液作為供試樣品溶液。試驗(yàn)中以每3盆菵草為1個(gè)處理，每處理重復(fù)3次。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 色譜條件 色譜柱為Shim-pack VP-ODS-C18柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇 ∶ 水=8 ∶ 2，體積流量為0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為25 ℃。

1.2.2.2 線性關(guān)系 考察精密稱取6-氯苯并唑酮，用甲醇配制成0.123～30 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，取上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣 10 μL，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。同法測(cè)得其他2種成分的回歸方程和線性范圍。

1.2.2.3 加樣回收率 試驗(yàn)精密稱取精唑禾草靈、精唑禾草酸、6-氯苯丙唑酮3種對(duì)照品各1 mg，用甲醇溶解，配制成3種藥品的濃度均為 100 μg/mL 的混合溶液。取未噴施精唑禾草靈的菵草，按“1.2.1”節(jié)的方法制得提取液，用提取液將上述藥品混合溶液稀釋成1、10、30 μg/mL，分別進(jìn)樣，測(cè)定3種對(duì)照品在不同濃度下的回收率（n=3）。

1.2.3 不同生物型菵草代謝精唑禾草靈速度差異的分析 取供試樣品溶液，進(jìn)樣20 μL，以外標(biāo)法用峰面積積分值計(jì)算菵草中精唑禾草靈、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法

在上述色譜條件下，檢測(cè)得目標(biāo)化合物精唑禾草靈、精唑禾草酸和6-氯苯并唑酮的保留時(shí)間分別是15.841、4.489、3.364 min，分離度良好（圖1）。

線性關(guān)系考察得到6-氯苯并唑酮的回歸方程為y=66.448x+46.056，r2=0.991 2，線性范圍為0.123～30.000 μg/mL；精唑禾草酸回歸方程為y=52.478x+1 971.1，r2=0.972 2，線性范圍為0.977～1 000.000 μg/mL；精唑禾草靈回歸方程為y=87.726x+38.241，r2=0.996 3，線性范圍為0.469～30.000 μg/mL。

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，精唑禾草靈的回收率在91.0%～98.0%之間，RSD為53%～7.9%；精唑禾草酸的回收率在80.0%～112.1%之間，RSD為4.9%～12.5%；6-氯苯丙唑酮回收率在96.0%～104.0%之間，RSD為7.8%～12.6%。

2.2 不同生物型菵草代謝精唑禾草靈速度差異的分析

2.2.1 樣品中精唑禾草靈含量的變化 在藥后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草靈的含量呈不斷下降趨勢(shì)，SD-04-SS生物型精唑禾草靈的含量總體略高于SD-12生物型。SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草靈的含量在藥后2 h到藥后 8 h 略有下降，在施藥后8 h后開(kāi)始快速下降，施藥后 72 h 后精唑禾草靈含量下降的速度趨緩，施藥后 96 h 后SD-04-SS生物型和SD-12生物型的精唑禾草靈含量已基本相同（表2）。

2.2.2 樣品中精唑禾草酸含量的變化 精唑禾草酸是精唑禾草靈在雜草體內(nèi)被水解后的產(chǎn)物，是起到除草作用的活性成分。由表3可知，在施藥后2 h即可在菵草中檢測(cè)到精唑禾草酸，說(shuō)明精唑禾草靈在施用后很快就被菵草吸收降解，這與前人在土壤微生物和大穗看麥娘上的研究[13-14]一致。在藥后2～144 h，SD-04-SS生物型和SD-12生物型中精唑禾草酸的含量呈不斷上升的趨勢(shì)。藥后2、8 h，SD-04-SS生物型和 SD-12生物型精唑禾草酸的含量并無(wú)明顯差異，但藥后24～144 h生物型SD-12的精唑禾草酸含量顯著高于抗性生物型SD-04-SS，說(shuō)明在此時(shí)間段內(nèi)抗性生物型SD-04-SS降解精唑禾草酸的速度快于敏感生物型 SD-12，這與2種生物型對(duì)精唑禾草靈的敏感性呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。

2.2.3 樣品中6-氯苯并唑酮含量的變化 精唑禾草酸在雜草體內(nèi)進(jìn)一步代謝為6-氯苯丙唑酮后失去除草活性，經(jīng)HPLC測(cè)定，抗性生物型SD-04-SS和敏感生物型SD-12生物型體內(nèi)6-氯苯丙唑酮的含量呈緩慢增加趨勢(shì)，在施藥后2 h即可檢測(cè)到6-氯苯丙唑酮的存在（表4），說(shuō)明敏感生物型和抗性生物型都能具備把精唑禾草酸降解為6-氯苯丙唑酮的能力。在施藥后2～144 h，敏感生物型和抗性生物型菵草體內(nèi)6-氯苯丙唑酮含量均無(wú)規(guī)律性變化，說(shuō)明6-氯苯丙唑酮含量不能體現(xiàn)菵草是否存在對(duì)精唑禾草靈的抗性，類似的現(xiàn)象曾在小麥和敏感馬唐、抗性大穗看麥娘和敏感大穗看麥娘之間觀察到過(guò)[2-3]。

3 結(jié)論與討論

精唑禾草酸是精唑禾草靈在雜草體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物，是起到除草作用的活性成分，被進(jìn)一步代謝為6-氯苯丙唑酮后失去活性。雜草可通過(guò)降低精唑禾草靈水解的速度或加速精唑禾草酸的降解以降低體內(nèi)精唑禾草酸的含量，減輕或免受除草劑的毒害作用。在雜草抗性研究中，一般采用放射性同位素標(biāo)記-高效液相色譜法對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行分析。該方法靈敏可靠，可對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，但同位素標(biāo)記試劑會(huì)損害身體健康、價(jià)格昂貴、廢棄物難以處理，而且需要在專門(mén)的實(shí)驗(yàn)室借助于專門(mén)設(shè)備才能進(jìn)行。高效液相色譜分離效率高、靈敏、快速、準(zhǔn)確，相比放射性同位素標(biāo)記法其成本低廉、對(duì)人體健康影響小、廢棄物易處理。本研究建立的精唑禾草靈及其主要代謝產(chǎn)物的HPLC分析方法穩(wěn)定、可靠，能反映出不同生物型菵草降解精唑禾草靈和精唑禾草酸速度的差異，具有更好的適用性。

本研究發(fā)現(xiàn)，在施藥后2 h就能在菵草體內(nèi)檢測(cè)到精唑禾草酸和6-氯苯丙唑酮的存在，說(shuō)明菵草很快就能吸收精唑禾草靈并進(jìn)行代謝反應(yīng)。從藥后24 h開(kāi)始，敏感生物型體內(nèi)的精唑禾草酸含量顯著高于抗性生物型，說(shuō)明抗性生物型 SD-04-SS降解活性成分精唑禾草酸的速度顯著快于敏感生物型SD-12，這是SD-04-SS生物型對(duì)精唑禾草靈產(chǎn)生抗性的代謝基礎(chǔ)。

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