雙氫青蒿素通過調(diào)節(jié)凋亡相關蛋白的表達及活性氧的產(chǎn)生而抑制胰腺癌JF305細胞的增殖

李亞巍+張巍+許娜+李妍+張紅+呂士杰+朱文赫

[摘要]探討雙氫青蒿素誘導人胰腺癌JF305細胞凋亡作用及活性氧在雙氫青蒿素誘導JF305細胞凋亡中的作用。采用MTT法考察不同濃度雙氫青蒿素對人胰腺癌JF305細胞增殖的影響，流式細胞術檢測細胞周期，Hochest 333258熒光染色法觀察細胞凋亡形態(tài)，Annexin V熒光染色法檢測JF305細胞凋亡的變化，DCFHDA檢測凋亡過程中活性氧（ROS）的變化。Western blot檢測細胞內(nèi)Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表達的變化。與對照相比，雙氫青蒿素作用JF305細胞48 h，細胞增殖受到明顯抑制（P<005）；細胞被阻滯于G2/M期；細胞出現(xiàn)核濃縮聚集、碎裂的凋亡形態(tài)，細胞凋亡比例升高（P<005）；DCFHDA檢測雙氫青蒿素給藥組細胞ROS明顯升高（P<005）；Western blot結果顯示，雙氫青蒿素作用后細胞內(nèi)Bcl2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl2蛋白表達比例升高，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C 蛋白表達升高。雙氫青蒿素能誘導JF305細胞凋亡，其凋亡過程可能與ROS的生成增加相關。

[關鍵詞]雙氫青蒿素； 胰腺癌； 細胞凋亡； 活性氧； 線粒體凋亡

Dihydroartemisinin inhibits proliferation of pancreatic cancer JF305

cells by regulating expression of apoptosis related proteins and

production of reactive oxygen species

LI Yawei， ZHANG Wei， XU Na， LI Yan， ZHANG Hong， LV Shijie， ZHU Wenhe*

（Jilin Medical College， Jilin 132013， China）

[Abstract]To investigate the effect of dihydroartemisinin on apoptosis of human pancreatic cancer cell line JF305 and the role of reactive oxygen species（ROS） in the apoptosis of JF305 cells induced by dihydroartemisinin MTT assays were used to detect effect of different concentrations of dihydroartemisinin on cells proliferation of JF305 lines Cell cycle was detected by flow cytometry， and the apoptotic morphology was observed by Hoechst 333258 fluorescence staining Annexin V fluorescence staining was used to detect the apoptosis changes of JF305 cells， while DCFHDA was used to detect the changes of ROS during apoptosis process Western blot was used to detect the protein expression changes of Bax， Bcl2， Cleaved caspase3， Cleaved caspase9 and Cyto C As compared with the control group， the JF305 cells proliferation was inhibited significantly（P<005） after treatment with different concentrations of dihydroartemisimin for 48 h； cell cycle was blocked in the G2/M phase； apoptotic morphology of nuclear condensation， aggregation， and fragmentation was found， and the apoptosis ratio was increased（P<005） DCFHDA detection showed that the cell ROS was increased significantly after dihydroartemisinin treatment（P<005） Western blot results showed that the expression of Bcl2 protein was downregulated； the expression of Bax protein was upregulated； the ration of Bax/Bcl2 was increased and the protein expression levels of Cleaved caspase3， Cleaved caspase9 and Cyto C were increased after dihydroartemisinin treatment Therefore， dihydroartemisinin could induce apoptosis of JF305 cells， and the possible mechanism may be related to the formation and increasing of ROS

[Key words]dihydroartemisinin； pancreatic cancer； apoptosis； reactive oxygen species； mitochondrial apoptosis

胰腺癌是我國較常見的惡性腫瘤，治療目前主要以放、化療為主，但是副作用較大[12]。因此，迫切需要尋找新的胰腺癌治療策略與藥物。青篙素是我國學者從中藥青篙中提取的含有過氧基團的倍半萜內(nèi)酯藥物，由于其高效低毒，能殺滅多重耐藥瘧原蟲，而廣泛應用于惡性瘧疾的治療[34]。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素類化合物體內(nèi)主要活性代謝物之一。近年研究發(fā)現(xiàn)[5]，雙氫青蒿素除了具有抗瘧疾作用外，可選擇性殺傷腫瘤細胞、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤生長，且毒副作用小，在抗腫瘤方面有著良好的應用前景。Singh等[6]研究發(fā)現(xiàn)，DHA可選擇性抑制乳腺癌細胞的生長，而對正常乳腺細胞無影響。DHA還可以下調(diào)肺癌細胞中HIF1α和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達水平，降低腫瘤微血管密度[7]。研究顯示[8]，DHA可顯著抑制HO8910PM高轉細胞株磷酸化黏著斑激酶（pFAK）的表達水平，但對總FAK水平無影響。提示DHA 可能通過FAK 途徑，抑制卵巢癌轉移。

雖然雙氫青蒿素在腫瘤治療中展現(xiàn)了潛在的引用價值，但是關于雙氫青蒿素對胰腺癌細胞增殖抑制作用及機制研究相關報道非常少。因此，本研究以人胰腺癌細胞JF305為研究對象，探討雙氫青蒿素對JF305增殖的抑制作用及其機制，為雙氫青蒿素在臨床胰腺癌治療中的應用奠定理論基礎。

1材料

人胰腺癌細胞JF305購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，由吉林醫(yī)藥學院生物化學教研室保存。細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 d更換培養(yǎng)液1次，待細胞長滿至培養(yǎng)瓶底，以025%胰酶消化傳代。

雙氫青蒿素購于Sigma公司；Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C抗體購于Santa Cruz公司；BCA（bicinchoninic acid）蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；Muse細胞分析儀購于默克密理博公司；550酶標儀購于美國BIORAD公司；CKX41A32PH倒置顯微鏡購于奧林巴斯公司。

2方法

21MTT法測定細胞增殖取對數(shù)生長期的JF305細胞，吸去細胞培養(yǎng)液，025%胰酶消化并用培養(yǎng)液調(diào)整細胞數(shù)至5×104個/mL。以每孔200 μL接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細胞貼壁后，給藥組分別給予濃度為40，80，160，240，320，480 μmol·L-1的雙氫青蒿素，對照組加入培養(yǎng)液，實驗組及對照組每孔各200 μL，每組設5復孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，按照20 μL/孔加入MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄培養(yǎng)孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL的DMSO，振蕩搖勻，在酶標儀上以波長490 nm 測各孔的吸光度A490。細胞生長抑制率= （1–A實驗組/A對照組）×100%。

22流式細胞術檢測細胞周期取對數(shù)生長期JF305細胞，025%胰酶消化后，按照10×105個/mL濃度接種于6孔板，24 h后分別加入不同濃度的雙氫青蒿素，培養(yǎng)48 h后，消化收集細胞，1 000 r·min-1離心5 min，棄去上清。預冷濃度為001 mol·L-1 PBS重懸細胞，離心、洗滌2次，用體積分數(shù)為70% 乙醇4 ℃固定過夜。PI避光染色30 min，檢測細胞周期。

23Hoechst 33258熒光染色檢測細胞凋亡形態(tài)取雙氫青蒿素處理48 h后的JF305細胞，加入05 mL 4%多聚甲醛固定液，室溫固定10 min。棄去固定液，用PBS洗2遍，3 min/次，吸盡液體。加入05 mL Hoechst 33258染色液，室溫避光染色5 min。用PBS洗2遍，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)的改變。

24細胞分析儀檢測凋亡雙氫青蒿素作用于JF305細胞48 h后，025%胰酶消化，收集細胞，離心后，PBS清洗2次，加入200 μL結合緩沖液（binding buffer）和5 μL膜聯(lián)蛋白（Annexin） Ⅴ，室溫避光30 min，加入5 μL碘化丙啶（PI），避光反應5 min流式細胞儀雙色分別分析早期凋亡（AnnexinV單陽性細胞）及中晚期凋亡細胞（AnnexinV、PI雙陽性細胞）占總細胞比例。

25JF305細胞內(nèi)活性氧（ROS）水平檢測DCFHDA自由擴散進入細胞后被酯酶催化變成DCFH，在活性氧存在的情況下被氧化成DCF，后者的熒光強度與細胞內(nèi)活性氧水平成正比。收集處理后1×106個/mL JF305細胞懸液，PBS 洗滌后，加入1 mL PBS液重懸，加入25 mmol·L-1的CDFHDA液40 μL，使終濃度為100 μmol·L-1，在37 ℃下避光孵育1 h，PBS洗滌后上流式細胞儀檢測。

26Western blot檢測凋亡相關蛋白的表達取藥物處理后的JF305細胞48 h，025%胰酶消化，離心收集細胞1 000 r·min-1離心10 min，以PBS洗2次，用PIPA細胞裂解液于冰浴裂解，12 000 r·min-1離心5 min，收集上清。經(jīng)BCA法進行蛋白定量后，取等量樣品以12%SDSPAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，兔抗人Bax，Bcl2，Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C抗體（濃度1∶1 000）孵育過夜，再以辣根過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1 h，用ECL顯影，掃描紀錄。

27統(tǒng)計學分析實驗數(shù)據(jù)均以±s表示，所有實驗數(shù)據(jù)均采用SPSS 130軟件處理，對照組與給藥各組比較進行單因素方差分析，以P<005為差異有統(tǒng)計學意義。

3結果

31雙氫青蒿素對JF305細胞增殖的抑制作用MTT結果顯示，不同濃度雙氫青蒿素作用JF305細胞48 h后，JF305細胞增殖受到明顯抑制作用，且隨雙氫青蒿素濃度增加，抑制作用顯著提高，呈現(xiàn)一定的劑量依賴性（P<005，圖1）。

32雙氫青蒿素對JF305細胞周期的影響流式細胞術檢測結果顯示，雙氫青蒿素作用于JF305細胞48 h后，細胞周期發(fā)生改變。隨著藥物濃度增加，G2/M期細胞比例逐漸增加。對照組G2/M期比例為1204%，而80，160，320 μmol·L-1給藥組細胞G2/M期細胞比例分別為179%，2411%，2839%，同對照組相比，差異具有統(tǒng)計學顯著性（P<005）。表明雙氫青蒿素作用JF305細胞后，細胞被阻滯于G2/M期。

33雙氫青蒿素對JF305細胞凋亡形態(tài)的影響Hochest 333258核染色結果顯示（圖2），與對照相比，雙氫青蒿素給藥組組的細胞凋亡明顯增多，細胞染色質固縮，細胞核呈致密濃染色，且胞核變小濃集，呈現(xiàn)凋亡細胞的特征。

34雙氫青蒿素對JF305細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測凋亡結果顯示，雙氫青蒿素作用JF305細胞48 h，細胞凋亡比例明顯增加。對照組JF305細胞早期凋亡率為（234±080）%，與對照相比，雙氫青蒿素給藥組隨著雙氫青蒿素給藥濃度的升高，JF305細胞凋亡率明顯升高（P<005），早期凋亡率分別為（1386±142）%，（1821±162）%，（2487±178）%。

35雙氫青蒿素對JF305細胞活性氧（ROS）水平的影響活性氧測定結果顯示，與對照組相比，JF305細胞內(nèi)活性氧的水平隨著雙氫青蒿素給藥濃度的升高呈現(xiàn)升高趨勢（P<005）。

36雙氫青蒿素對JF305細胞內(nèi)凋亡相關蛋白表達的影響Western blot結果顯示，與對照組相比，不同濃度雙氫青蒿素給藥組JF305細胞Bcl2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl2蛋白表達比例升高，為了進一步探討其誘發(fā)JF305細胞凋亡的作用機制，檢測了Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表達情況。結果顯示Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表達均明顯上調(diào)。上述結果表明雙氫青蒿素促JF305細胞凋亡機制可能與線粒體凋亡途徑相關（圖3）。

4討論

雙氫青篙素是一種重要的青篙素衍生物，在臨床上具有毒性較小并且療效突出的特點，對腦瘧等惡性瘧疾有很好的治療效果。近年來雙氫青蒿素的抗腫瘤作用也得到了學者的廣泛關注。據(jù)文獻報道[910]，雙氫青蒿素對胃癌、結腸癌、胰腺癌、白血病、乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤細胞增殖均具有抑制作用。但是對于胰腺癌細胞，尤是其對胰腺癌細胞作用機制的研究相對較少。因此，本研究以人胰腺癌細胞JF305為研究對象，探討雙氫青蒿素抗胰腺癌的作用及其機制。

本實驗首先通過MTT實驗觀察雙氫青蒿素對JF305細胞增殖抑制作用。結果顯示雙氫青蒿素能抑制JF305細胞的增殖，其抑制作用隨著雙氫青蒿素藥物濃度的升高呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。細胞周期檢測結果顯示，雙氫青蒿素作用于JF305細胞48 h后，JF305細胞G2/M期細胞比例明顯增加，細胞被阻滯于G2 /M期。流式細胞儀檢測凋亡結果顯示，雙氫青蒿素作用JF305細胞48 h后，細胞凋亡比例增加，可以判斷雙氫青蒿素是通過細胞凋亡方式來抑制腫瘤細胞的增殖的。細胞內(nèi)ROS水平檢測發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素作用后胰腺癌JF305細胞內(nèi)的ROS明顯增加，且在一定的濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴。活性氧作為細胞代謝中不可避免的產(chǎn)物，能夠通過介導多種信號通路以促進細胞凋亡、細胞壞死以及自噬性細胞死亡等方式發(fā)揮抗腫瘤作用。Zhao等[11]研究發(fā)現(xiàn)，MMPT能夠抑制A549肺癌細胞生長和誘導其凋亡，而這個過程主要通過ROS依賴途徑來實現(xiàn)，期間伴隨著ROS的生成增加。而本研究結果顯示，雙青蒿素作用后能夠促使JF305細胞內(nèi)ROS的增加，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。

活性氧是細胞凋亡的早期信號，它可作用于線粒體，促使線粒體膜通透性改變、線粒體膜電位下降、細胞色素C釋放，它還能與Apaf1，caspase9前體，ATP/dATP形成凋亡體，然后召集并激活caspase9，caspase3，進而引發(fā)caspases 級聯(lián)反應，使DNA 斷裂，引起細胞凋亡[1214]。為了明確雙氫青蒿素誘導JF305細胞凋亡的分子機制，通過Western blot檢測細胞內(nèi)蛋白表達的情況。結果顯示，雙氫青蒿素作用48 h后，JF305細胞Bcl2蛋白表達下調(diào)，Bax蛋白表達上調(diào)，Bax/Bcl2蛋白表達比例升高，結果顯示Cleaved caspase3，Cleaved caspase9和Cyto C蛋白表達均明顯上調(diào)。線粒體途徑是由Bcl2家族成員Bcl2，Bad 等信號蛋白組成，這些信號蛋白在受到胞內(nèi)的死亡信號后激活。Bcl2與另外的Bcl2 家族成員如Bax主要松散的結合在線粒體外膜面或存在于胞漿作用，導致后者的寡聚并插入線粒體膜，引起線粒體通透性的改變，跨膜電位丟失，釋放細胞色素C[1517]。本研究結果表明，雙氫青蒿素誘導JF305細胞凋亡的分子機制可能與改變細胞內(nèi)ROS水平引起的線粒體凋亡途徑相關。

綜上所述，雙氫青蒿素可以抑制胰腺癌JF305細胞的增殖，并能誘發(fā)細胞凋亡，其機制可能與雙氫青蒿素升高JF305細胞ROS的水平引起的線粒體凋亡途徑相關。本研究為雙氫青蒿素在臨床胰腺癌治療奠定基礎，但是具體機制任然有待進一步的研究。

[參考文獻]

[1]萬君，盧銀忠，鄭軍，等三種信號通路抑制劑兩兩聯(lián)合用藥對胰腺癌細胞Panc28和Panc1增殖的影響[J]中國藥理學與毒理學雜志， 2016， 30 （11）： 1156

[2]Lennon A M， Wolfgang C L， Canto M I， et al The early detection of pancreatic cancer： what will it take to diagnose and treat curable pancreatic neoplasia？ [J] Cancer Res， 2014， 74（13）： 3381

[3]Lin R， Zhang Z， Chen L， et al Dihydroartemisinin（DHA） induces ferroptosis and causes cell cycle arrest in head and neck carcinoma cells [J] Cancer Lett， 2016， 381（1）： 165

[4]Zhang Z S， Wang J， Shen Y B， et al Dihydroartemisinin increases temozolomide efficacy in glioma cells by inducing autophagy [J] Oncol Lett， 2015， 10（1）： 379

[V5]Liu Y， Wang W， Xu J， et al Dihydroartemisinin inhibits tumor growth of human osteosarcoma cells by suppressing Wnt/betacatenin signaling [J] Oncol Rep， 2013， 30（4）： 1723

[6]Singh N P， Lai H Selective toxicity of dihydroartemisinin and holotransferrin toward human breast cancer cells [J] Life Sci， 2001， 70（1）： 49

[7]Zhang J L， Wang Z， Hu W， et al DHA regulates angiogenesis and improves the efficiency of CDDP for the treatment of lung carcinoma [J] Microvasc Res， 2013， 87（5）：14

[8]吳步初，胡柯，李姝，等雙氫青蒿素對卵巢上皮性癌發(fā)展和轉移的影響[J]現(xiàn)代婦產(chǎn)科進展， 2013， 22（11）： 873

[9]Ismail H M， Barton V， Phanchana M， et al Artemisinin activitybased probes identify multiple molecular targets within the asexual stage of the malaria parasites Plasmodium falciparum 3D7 [J] Proc Natl Acad Sci USA， 2016， 113（8）： 2080

[10]Zhang S， Shi L， Ma H， et al Dihydroartemisinin induces apoptosis in human gastric cancer cell line BGC823 through activation of JNK1/2 and p38 MAPK signaling pathways [J] J Recept Signal Transduct Res， 2017， 37（2）：174

[11]Zhao Y F， Zhang C， Suo Y R MMPT as a reactive oxygen species generator induces apoptosis via the depletion of intracellular GSH contents in A549 cells [J] Eur J Pharm， 2012， 688（1/3）： 6

[12]Jacquemin G， Margiotta D， Kasahara A， et al Granzyme Binduced mitochondrial ROS are required for apoptosis [J] Cell Death Differ， 2015， 22（5）： 862

[13]Okon I S， Zou M H Mitochondrial ROS and cancer drug resistance： implications for therapy [J] Pharmacol Res， 2015， 100： 170

[14]Zorov D B， Juhaszova M， Sollott S J Mitochondrial reactive oxygen species （ROS） and ROSinduced ROS release [J] Physiol Rev， 2014， 94（3）： 909

[15]Bing P， Yang M， Qi X， et al Quercetin ameliorates ischemia/reperfusioninduced cognitive deficits by inhibiting ASK1/JNK3/caspase3 by enhancing the Akt signaling pathway [J] Biochem Biophys Res Commun， 2016， 478（1）： 199

[16]Kiekow C J， Figueiró F， Dietrich F， et al Quercetin derivative induces cell death in glioma cells by modulating NFκB nuclear translocation and caspase3 activation [J] Eur J Pharm Sci， 2016， 84： 116

[17]Yang J， He F， Meng Q， et al Inhibiting HIF1α decreases expression of TNFα and Caspase3 in specific brain regions exposed kainic acidinduced status epilepticus [J] Cell PhysiolBiochem， 2016， 38（1）： 75

[責任編輯張寧寧]