高效液相色譜法測定人血漿中伏立康唑濃度及其應用

劉 亮，郭美華，陳 巖，魯 靜，錢 釗，高春璐，海 鑫（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

·實驗研究·

高效液相色譜法測定人血漿中伏立康唑濃度及其應用

劉 亮，郭美華，陳 巖，魯 靜，錢 釗，高春璐，海 鑫（哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150001）

目的：建立一種簡單、準確的測定人血漿中伏立康唑濃度的方法，并應用于臨床伏立康唑血藥濃度監測，以促進個體化用藥。方法：采用高效液相色譜法，以酮康唑為內標。色譜柱：Waters Symmetry C18柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.01 mol·L-1醋酸銨溶液（50 : 50），流速1.0 mL·min-1，紫外檢測波長255 nm，柱溫40 ℃，進樣量40 μL。結果：伏立康唑在0.1 ～ 20.0 μg·mL-1范圍內線性良好，r= 0.999 7。定量下限為0.1 μg·mL-1。伏立康唑高、中、低三個濃度的提取回收率分別是96.24% ～ 101.61%、89.06% ～ 93.55%、83.76% ～ 108.87%。日內精密度RSD ＜ 9.44%，日間精密度RSD ＜ 5.56%。本方法測定患者的伏立康唑血漿藥物濃度分別為6.36、4.98、0.54 μg·mL-1。結論：該方法靈敏度高，操作簡便，結果準確，適用于伏立康唑血藥濃度監測。

伏立康唑；血藥濃度監測；高效液相色譜法

伏立康唑（voriconazole，VRC）是第二代三唑類抗真菌藥物，該藥在氟康唑的基礎上引入甲基，并以氟代嘧啶環取代了氟康唑的三唑環，通過抑制真菌細胞膜麥角固醇的合成，從而抑制真菌的生長[1-2]。伏立康唑具有廣譜抗菌作用，尤其是對急性侵襲性曲霉菌、 侵襲性念珠菌、食道球菌分支霉菌屬和鐮孢菌屬具有較強的抗菌活性[3]。伏立康唑在人體內呈非線性藥動學過程，且受基因型及藥物相互作用的影響[4]，不同人的血藥濃度差異很大。因此，對伏立康唑的血藥濃度監測十分必要[2]。目前，伏立康唑的血藥濃度測定方法很多，主要有高效液相色譜法、液質聯用等方法[5]。由于多數方法繁瑣復雜，本研究通過改進文獻中的方法，建立一種操作簡便、準確、穩定的伏立康唑血藥濃度監測方法，用于臨床伏立康唑藥物濃度監測。

1 實驗材料

1.1 儀器

高效液相色譜儀20A（日本島津公司）；3-30K高速離心機（德國Sigma公司）；Vortex Genius 3漩渦混合器（德國IKA公司）；Branson 5800醫用超聲波清洗器（美國BRANSON公司）；MTN-2800W氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Barnstead GenPure ProUV純水器（美國賽默飛世爾公司）；XS205十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多國際貿易有限公司）；Research Plus移液器（德國Eppendorf公司）。

1.2 試劑

伏立康唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：99.7%，批號201402）；酮康唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，含量：99.4%，批號201203）；乙腈和甲醇為色譜純（賽默飛世爾科技公司），水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗

色譜柱為Waters Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.01 mol·L-1醋酸銨溶液（50 : 50）；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：255 nm；內標：酮康唑；柱溫：40 ℃；進樣量（自動進樣）：40 μL。系統適用性實驗理論塔板數、分離度均符合相關要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品儲備液精密稱取伏立康唑10.00 mg，置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1000 μg·mL-1伏立康唑對照品儲備液，置于4 ℃冷藏。精密稱量上述已配好的儲備液2 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成200 μg·mL-1的伏立康唑標準對照品工作液，采用倍比稀釋配成200、100、40、20、10、5、1 μg·mL-1系列濃度的伏立康唑對照品工作液，置于4 ℃冰箱中存放備用。同法配成160、80、2 μg·mL-1三個水平的伏立康唑質量控制（QC）工作液，置于4 ℃冰箱中存放備用。

2.2.2 內標溶液方法同上，配制酮康唑內標溶液100 μg·mL-1，置于4 ℃冰箱中存放備用。

2.3 血漿樣品的處理

取出血漿在室溫下融化后搖勻，用移液器精密移取血漿樣品500 μL置于2 mL EP管中，加入內標溶液50 μL，混勻后加入1 mL乙腈，渦旋30 s后離心5 min（13 000 r·min-1），取上清液于1.5 mL EP管中，于室溫條件下氮氣吹干，加入200 μL流動相振蕩復溶，離心5 min（13 000 r·min-1），取上清液，待分析。

2.4 方法學驗證

2.4.1 特異性分別取空白血漿、空白血漿含內標、空白血漿含伏立康唑對照品、空白血漿含內標與伏立康唑對照品4種樣品按“2.3”項下方法處理后進樣，色譜圖見圖1。由圖可看出內標色譜峰與目標物色譜峰完全分離，其他雜質不干擾兩者的測定，峰形理想。

2.4.2 標準曲線的繪制及定量下限取離心管，分別加入空白血漿450 μL，再精密量取已經配好系列濃度的伏立康唑對照品溶液各50 μL，得到濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 μg·mL-1的血漿樣品，將此樣品依照“2.3”項下相應步驟處理，并記錄色譜圖與峰面積。以伏立康唑色譜峰面積與內標酮康唑色譜峰面積之比（Y）對已知伏立康唑濃度（X）進行回歸分析。回歸方程為Y = 0.129 8 X + 0.009 5，r = 0.999 7。線性范圍：0.1 ～ 20.0 μg·mL-1。定量下限為0.1 μg·mL-1。

2.4.3 精密度和回收率實驗日內精密度：在同一天內，用空白血漿與伏立康唑對照品溶液制成濃度分別為0.20、8.00、16.00 μg·mL-1的樣品各5份，按“2.3”項下方法操作，進樣分析，計算均值，標準差及相對標準差。日間精密度同法配制濃度分別為0.20、8.00、16.00 μg·mL-1的血漿樣品，依照上述方法測定處理，連續測定5 d，同法計算。

相對回收率：按“2.2.1”項下方法重新配置伏立康唑對照品儲備液，稀釋后制成濃度為0.20、8.00、16.00 μg·mL-1的樣本各5份，按“2.3”項下同法操作，進樣分析，將所得的伏立康唑峰面積與內標物峰面積比值帶入回歸方程計算出濃度值，以測得值與實際值作比計算相對回收率。結果見表1，可見準確度良好。

提取回收率用空白血漿和伏立康唑對照品溶液制成濃度為0.20、8.00、16.00 μg·mL-1的樣本各5份，按“2.3”項下處理，但最后加內標，進樣分析，伏立康唑與內標峰面積比為R1，空白血漿按正常方式提取，最后加入等量的伏立康唑與內標，伏立康唑與內標峰面積比為R2。按公式：提取回收率（%）=（R1/R2）×100%計算。結果見表2，符合樣本分析的要求。

圖1 HPLC色譜圖A – 空白血漿，B – 空白血漿+伏立康唑，C – 空白血漿+內標，D –空白血漿+伏立康唑+內標；1 – 伏立康唑，2 –內標Fig 1 HPLC chromatogramsA – blank plasma, B – blank plasma + voriconazole, C – blank plasma + internal standard, D – blank plasma + voriconazole + internal standard; 1 – voriconazole, 2 – internal standard

表1 伏立康唑血漿樣品的精密度和相對回收率.n= 5Tab 1 Precision and relative recovery of voriconazole in plasma.n= 5

表2 伏立康唑血漿樣品提取回收率.n= 5Tab 2 Extraction recovery of voriconazole in plasma.n= 5

2.4.4 穩定性實驗反復凍融穩定性：同上述方法配制0.20、8.00、16.00 μg·mL-1的樣品，于– 40 ℃冰箱內冷凍24 h后，取出樣品，融化完全，反復凍融3次后按“2.3”項下方法操作，進樣分析，每種濃度的樣品3份，同法計算。

長期穩定性：同上述方法配制同樣濃度樣品，于冰箱– 40 ℃中放置35 d后，每種濃度測定3管樣品，同法計算。結果見表3。

表3 伏立康唑血漿樣品的凍融穩定性與長期穩定性.n= 3Tab 3 Freeze-thaw and long-term stability of voriconazole in plasma.n= 3

2.5 患者血漿測定

取待測血漿，按“2.3”項下方法進行處理，進樣分析，用已建立標準曲線計算樣品中伏立康唑的含量，質控樣本平行測定。測定患者的伏立康唑血漿藥物濃度分別為6.36、4.98、0.54 μg·mL-1。

3 討論

三唑類抗真菌藥物是臨床上應用廣泛的抗真菌藥物，因該類藥物可與體內的P-450蛋白血紅素輔基Fe原子配位結合，普遍具有一定的肝、腎毒性[6]。因此，對此類藥物的臨床監測十分必要。伏立康唑為新型三唑類抗真菌藥物，是治療侵襲性真菌感染的常見藥物之一[7]。伏立康唑的血藥濃度監測方法有多種。其中質譜分析方法靈敏度高，檢測范圍廣，但由于樣品處理較復雜，成本昂貴等限制，難以在臨床上推廣[8]。與質譜法相比，高效液相色譜紫外檢測法具有經濟適用，穩定性好，被廣泛應用于血藥濃度監測領域中。國內關于高效液相色譜法測定伏立康唑血藥濃度已有報道，多采用乙酸乙酯-環己烷或氯仿等萃取劑進行提取[8-10]，血漿前處理操作繁瑣、復雜。為了簡化實驗步驟，我們曾嘗試采用外標法，血漿用乙腈沉淀后直接過濾上樣，結果顯示此方法雜質峰干擾太多，外標法直接沉淀未能達到檢測要求，不適用于伏立康唑的檢測。經過反復實驗，最終通過加入內標，將樣品氮吹濃縮純化，結果峰形完好。

文獻中關于伏立康唑內標的選擇有多種，如卡馬西平、尼群地平、勞拉西泮、酮康唑等，我們選取伏立康唑的結構類似物酮康唑作為內標。實驗初期，加入50 μL濃度為20 μg·mL-1的酮康唑，結果顯示內標峰面積與伏立康唑峰面積相比過小，經過反復研究，最終選擇內標的濃度為100 μg·mL-1。

伏立康唑濃度個體間差異大，國內外有文獻[11-12]推薦伏立康唑有效濃度為1.0 ～ 5.5 μg·mL-1，本方法結果表明伏立康唑濃度在0.1 ～ 20.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好，覆蓋了伏立康唑的有效濃度范圍。我們對本院3例真菌感染患者用此方法進行檢測，伏立康唑的谷濃度分別是6.36、4.98、0.54 μg·mL-1，3例真菌感染患者中僅有1例患者伏立康唑濃度在此推薦范圍內，可依據此結果及患者的病情進行適當調整劑量。

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《中國藥物應用與監測》開通優秀論文發表綠色通道

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Determination of voriconazole in human plasma by HPLC and its application

LIU Liang, GUO Mei-hua, CHEN Yan, LU Jing, QIAN Zhao, GAO Chun-lu, HAI Xin(Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Harbin 150001, China)

Objective:To establish a simple and accurate method for the determination of voriconazole in human plasma. This method was used to monitor voriconazole blood concentration and promote the individualized medication.Methods:With ketoconazole as the internal standard, the chromatographic column was the Waters Symmetry C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm), the mobile phase was acetonitrile-0.01 mol·L-1ammonium acetate solution (50 : 50). The detection wavelength was 255 nm with the fl ow rate of 1.0 mL·min-1, and the column temperature was 40 ℃. The injection volume was 40 μL.Results:The concentration of voriconazole in the range of 0.1 – 20.0 μg·mL-1(r= 0.999 7) showed the good linearity. The lower limit of quantitation was 0.1 μg·mL-1. The recovery rates of low, middle and high concentrations were 96.24% – 101.61%, 89.06% – 93.55% and 83.76% –108.87%, respectively. The intra-day RSDs were less than 9.44% and the inter-day RSDs were less than 5.56%. The concentration of voriconazole in patient plasma were 6.36, 4.98, 0.54 μg·mL-1, respectively by the method.Conclusion:The method was sensitive, simple, accurate and applicable for voriconazole blood concentration monitoring.

Voriconazole; Blood drug concentration monitoring; HPLC

R917

A

1672 – 8157(2017)04 – 0205 – 04

2016-12-06

2017-03-26）

海鑫，女，副主任藥師，主要從事藥物分析，臨床藥學工作。E-mail：69330580@qq.com

劉亮，男，藥師，主要從事治療藥物監測工作。E-mail：976719372@qq.com