HPLC法測定參萸清眩膏中馬錢苷的含量

王秀琴，王東興，徐春靜，史志新，錢秋玉，陳 軍（陸軍總醫院263臨床部藥劑科，北京 101149）

HPLC法測定參萸清眩膏中馬錢苷的含量

王秀琴，王東興，徐春靜，史志新，錢秋玉，陳 軍（陸軍總醫院263臨床部藥劑科，北京 101149）

目的：建立測定參萸清眩膏含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（11 : 89）；檢測波長：240 nm；柱溫：30 ℃，流速：1.0 mL·min-1。結果：馬錢苷與其它雜質峰分離良好。馬錢苷在11.20 ～ 112.00 μg·mL-1范圍內與色譜峰面積呈現良好的線性關系（r= 0.999 9，n= 7），平均回收率為99.9%，RSD = 1.75%（n= 9）。結論：本方法操作簡便、準確、重復性好，可用于參萸清眩膏含量的測定。

高效液相色譜法；馬錢苷；含量測定

參萸清眩膏由山茱萸、熟地黃、菟絲子、黨參、枸杞子等九味中藥組成的復方制劑，用于各種原因引起的眩暈的防治。該制劑原質量標準中無含量測定，只鑒別山茱萸、肉蓯蓉、枸杞子，不足以控制制劑的質量，為提高該制劑的質量標準，本實驗參考相關文獻[1-4]，采用高效液相色譜法，測定制劑中君藥山茱萸有效成分馬錢苷的含量。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BT125D型電子天平（德國賽多利斯）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；LDZ5-2型離心機（北京京立離心機有限公司）；CQ-800B型超聲儀（深圳市科潔超聲科技有限公司）；乙腈（色譜純，國家集團化學試劑有限公司）。

馬錢苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111640-201005，置五氧化二磷減壓干燥器中干燥12小時后使用，純度：99.2%）；其它試劑均為分析純。參萸清眩膏（本院自制，250 mL/瓶，批號：150309、150107、150520）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（11∶89）；檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；理論板數按照馬錢苷峰計算應不低于3000。

2.2 溶液的制備

（1）對照品溶液：取馬錢苷對照品約10 mg，精密稱定置50 mL量瓶中加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。精密量取2 mL對照品儲備液置10 mL量瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得（10 ℃以下保存）。

（2）供試品溶液：取本品約2 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加入80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上層清液，濾過，即得。

（3）陰性對照溶液：取不含山茱萸的參萸清眩膏陰性樣品約2 g，同供試品溶液制備法制備。

2.3 系統適用性實驗

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各5 μL，注入液相色譜議，按“2.1”項下色譜條件進行測定。實驗表明：對照品主峰與供試品主峰保留時間一致，陰性樣品無干擾，專屬性良好，結果見圖1。

2.4 線性關系考察

精密稱取馬錢苷對照品11.29 mg，置于50 mL量瓶中，加80%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。再分別精密量取儲備液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、 3.0、5.0 mL于10 mL量瓶中，用80%甲醇定容，搖勻，即得系列濃度對照品溶液。分別精密吸取系列濃度對照品溶液各5 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程：Y= 8.420 7X+ 0.859 2，r= 0.999 9。結果表明馬錢苷進樣量在11.20 ～ 112.00 μg·mL-1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

圖1 HPLC色譜圖A – 對照品溶液，B – 供試品溶液，C – 陰性對照溶液，D – 溶劑；1 –馬錢苷Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance, D – solvent; 1 – loganin

2.5 精密度實驗

精密吸取馬錢苷對照品溶液5 μL，注入液相色譜議，按“2.1”項下色譜條件進行測定，連續重復進樣6次，記錄色譜圖，計算馬錢苷峰面積的RSD為0.40%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性實驗

取同一批樣品（批號150309）6份，按“2.2”項下方法制備，依法測定。結果表明，參萸清眩膏中馬錢苷含量平均值為0.300 6 mg·g-1（RSD = 0.88%，n= 6），表明方法重復性良好。

2.7 穩定性實驗

取同一批樣品（批號150309）制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h測定，馬錢苷峰面積RSD為1.54%，表明供試品溶液在12 h內穩定。馬錢苷峰面積的RSD為1.54%（n= 7），表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.8 回收率實驗

精密稱取馬錢苷對照品13.76 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為加樣用馬錢苷溶液。分別取0.8、1.0、1.2 mL加樣用馬錢苷溶液，按低（80%）、中（100%）、高（120%）三個劑量組，置于25 mL量瓶中再分別精密稱取同一批已知含量的樣品（批號150309）9份，每份約1.0 g，加入80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，離心，取上層清液，濾過，依法測定，計算得馬錢苷的平均回收率為99.91%，RSD為1.75%。見表1。

表1 馬錢苷加樣回收率實驗結果.n= 9Tab 1 Results of recovery test for loganin.n= 9

2.9 樣品含量測定

取不同的3批樣品（批號150309、150107、150520），按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行含量測定，測定數據與結果詳見表2。

2.1 0 方法耐用性實驗

取本品（批號150309）按“2.1”項下方法制備供試品溶液，使用不同品牌的色譜柱，色譜條件不變，測定馬錢苷的含量，結果見表3。

3 討論

3.1 參萸清眩膏指標成分及含量測定方法的選擇

參萸清眩膏由山茱萸、熟地黃、菟絲子、黨參、枸杞子等九味中藥組成的復方制劑，山茱萸性味酸、澀、微溫，歸肝、腎經，具有補益肝腎、澀精固脫功效，用于眩暈耳鳴、腰膝酸痛、陽痿遺精等。參萸清眩膏為非標制劑，組成成分復雜，含量指標選擇較難確定，該制劑原質量標準中未對其進行含量測定。根據《中國藥典》、參考相關文獻及專家審批建議[1-6]，選定處方組成中的君藥山茱萸的有效成分馬錢苷作為指標成分，采用HPLC法對其進行含量測定，經方法學驗證，該法操作簡便、專屬性強、結果準確，適用于該制劑的質量控制。

表2 馬錢苷含量測定結果.n= 3Tab 2 Contents determination of loganin.n= 3

表3 不同類型色譜柱測得馬錢苷含量.n= 3表3 Contents determination of loganin by different types of columns.n= 3

3.2 參萸清眩膏含量限度的確定

本制劑為中藥制劑，進行含量限度測定須注意是在保證藥物成分對臨床安全和療效穩定的情況下，并具有足夠的代表性的樣品實驗數據為基礎，結合藥材含量及工藝回收率綜合分析制定。本研究所測成分的原料為粉末、提取物入藥，該成分的轉移率應不低于85%，且所測成分的原料在制備工藝中經溶劑提取時，該成分轉移率一般應不低于30%。

3.3 HPLC法測定條件的優化

3.3.1 檢測波長選擇參考文獻[3,6]并采用二級管陣列檢測器（DAD）進行全波長掃描顯示，馬錢苷在240 nm波長范圍處有最大吸收，峰形良好且不受雜質峰和溶劑峰的干擾，因此選擇240 nm作為檢測波長。

3.3.2 流動相的選擇本研究選用了乙腈-水作為流動相[7-8]，經過多次實驗確定了以乙腈-水（11 : 89）比例為馬錢苷含量測定的流動相，峰形好、分離度和保留時間合理，基線平穩，靈敏度高，重現性和回收率好，完全能滿足該品種質量標準的要求，理論塔板數達9000以上，能作為參萸清眩膏的質量控制方法。

3.3.3 色譜柱的選擇參考文獻[9-11]并根據三種類型的色譜柱[Agilent ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Bridge C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Thermo Hypersil GOLD C18柱（4.6 mm×150mm，5 μm）]的實驗結果，最終選擇以馬錢苷含量較高，指標成分峰形和分離度好的Agilent ZORBAX SBC18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）作為色譜柱，建立的含量測定方法快速、簡捷、準確度高，基質對測定無干擾、分離效果好，可用于參萸清眩膏中馬錢苷的含量測定。

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Content determination of loganin inShenyuqingxuanelectuary by HPLC

WANG Xiu-qin, WANG Dong-xing, XU Chun-jing, SHI Zhi-xin, QIAN Qiu-yu, CHEN Jun(Pharmacy of 263 Clinical Department of the Army General Hospital, Beijing 101149, China)

Objective:To establish the HPLC method for determining the content ofShenyuqingxuanelectuary.Methods:HPLC analysis was carried out with Agilent ZORBAX SB-C18column (4.6 mm × 150 mm, 5 μm), the mobile phase consisted of acetonitrile-water (11 : 89), the detection wavelength was 240 nm, the column temperature was 30 ℃and the fl ow rate was 1.0 mL·min-1.Results:The samples were separated well from impurities by HPLC method. Loganin was linear in the range of 11.20 – 112.00 μg·mL-1(r= 0.999 9,n= 7). The average recovery and RSD of loganin were 99.9% and 1.75% (n= 9).Conclusion:This method is simple, accurate and repeatability, which can be applied as the quantitative method for the determination of loganin inShenyuqingxuanelectuary.

HPLC; Loganin; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)04 – 0211 – 04

2017-02-27

2017-05-04）

軍隊十二五面上項目，軍隊醫療機構制劑質量標準計劃（14ZJZ06-1）

錢秋玉，女，主管藥師，研究方向：藥品分析與藥品質量控制。E-mail：568175262@qq.com

王秀琴，女，副主任藥師，主要從事藥事管理及臨床藥學工作。E-mail：wangxq69@163.com