HPLC法測定心腎安顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量

范金釗，丁曉芳，白 林，李 欣（.解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 00853；.安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 33000）

HPLC法測定心腎安顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量

范金釗1，丁曉芳2，白 林1，李 欣1（1.解放軍總醫(yī)院制劑中心，北京 100853；2.安徽蚌埠醫(yī)學(xué)院，安徽 蚌埠 233000）

目的：建立心腎安顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的測定方法。方法：色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（16 : 84）；檢測波長：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃。結(jié)果：2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在3.767 4 ～ 25.116 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r= 1）；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均回收率為99.80%；RSD為1.47%（n= 9）。結(jié)論：本方法操作簡單，專屬性強(qiáng)，靈敏度高，可用于心腎安顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量測定。

HPLC；心腎安顆粒；2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷；含量測定

心腎安顆粒是解放軍總醫(yī)院非標(biāo)準(zhǔn)制劑，由黨參、黃芪、當(dāng)歸、何首烏等20味中藥組成，具有強(qiáng)心益腎，活血化瘀，舒筋活絡(luò)，舒肝養(yǎng)血等功效。該藥用于心腎陽虛，精血不足所致的疲倦乏力，心悸怔忡，腰膝酸軟，畏寒，肢冷，小便余瀝，不孕不育及更年期綜合癥，前列腺增生等癥。何首烏具有補肝腎，益精血，烏須發(fā)，強(qiáng)筋骨之效[1]，何首烏的主要活性成分是2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。本研究采用HPLC法對心腎安顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行含量測定，旨為該制劑的質(zhì)量控制提供理論參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；MS205DU電子天平（德國METTLER TOLEDO公司）；UV-2550紫外分光光度計（日本島津公司）；BQ-12超聲清洗機(jī)（北京精益榮華首飾器材有限公司）。

2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，純度：91.0%，批號110844-201310）；心腎安顆粒（本院自制，規(guī)格：5 g，批號：140601，140602，140302）；乙腈為色譜純。

2 方法

2.1 色譜條件

Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（16 : 84）；檢測波長：320 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃[2]；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。再精密量取儲備液0.5 mL至10 mL棕色容量瓶中，加稀乙醇定容到刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液取心腎安顆粒研成細(xì)粉，取約1.0 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，加稀乙醇30 mL，稱定重量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，加稀乙醇補足減失的重量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液按該制劑處方取除何首烏以外的其余成分，制備成陰性樣品，并按上述供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣分析，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰和其他成份色譜峰分離度大于1.5，且陰性樣品無干擾。見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A – 對照品，B – 供試品，C – 陰性樣品；1 – 2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷Fig 1 HPLC chromatogramsA – reference substance, B – sample, C – negative reference substance; 1 – 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside

2.4 線性關(guān)系考察

取2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，精密稱定，加稀乙醇使溶解，制得濃度為3.767 4、6.279 0、12.558 0、18.837 0、25.116 0 μg·mL-1的系列對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，進(jìn)樣記錄，以2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為：Y= 47.572X– 0.363 3（r= 1），結(jié)果表明，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在3.767 4 ～ 25.116 0 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積RSD為0.34%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實驗

取同一批次心腎安顆粒（批號1460602）約1 g，共6份，精密稱定，分別按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定，計算2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量RSD為1.43%。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性考察

取心腎安顆粒約1 g，精密稱定，制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件，在室溫條件下，分別于0、2、4、6、8 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的峰面積RSD為1.43%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率實驗

取已知含量的心腎安顆粒（批號1460601）9份，每份約1.3 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品儲備液，按“2.2”項下方法制備成供試品溶液，進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 心腎安顆粒加樣回收率實驗結(jié)果.n= 9Tab 1 Results of recovery test forXinshenangranules.n= 9

2.9 含量測定

取心腎安顆粒3批，每批心腎安顆粒3份，按“2.2.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，每份供試品溶液進(jìn)樣2次，詳見表2。

表2 心腎安顆粒含量測定結(jié)果.n= 3Tab 2 Contents determination ofXinshenangranules.n= 3

3 討論

3.1 提取方法和時間的考察

分別考察在乙醇、稀乙醇、甲醇[3-5]中的提取率，結(jié)果表明在稀乙醇中提取率相對較高；對2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷進(jìn)行超聲、回流提取[6-7]，并對超聲、回流法提取時間進(jìn)行考察，試驗結(jié)果表明加熱回流與超聲處理30 min提取率高且相近，考慮到操作的便捷性，最終采用稀乙醇超聲處理30 min[3-5]。

3.2 流動相的考察

曾參考《中國藥典》2015年（一部）何首烏藥材的含量測定方法[1]，以乙腈-水（25 : 75）為流動相進(jìn)行含量測定，結(jié)果顯示2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度較低，因此篩選流動相比例，選用乙腈-水（16 : 84）作為流動相，2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離度大于1.5，峰形對稱，靈敏度高。

經(jīng)方法學(xué)考查，本文建立的檢測方法操作簡便，分離度好，重現(xiàn)性佳，回收率高，能更好的控制心腎安顆粒的質(zhì)量。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：175-176.

[2] 白林，范金釗，徐風(fēng)華，等.HPLC法測定復(fù)方樟腦軟膏中樟腦的含量[J].中國藥物應(yīng)用與監(jiān)測，2014，11（4）：212-213.

[3] 董志同，李妍.RP-HPLC法測定參竹精顆粒中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中國民族醫(yī)藥雜志，2015，（7）：64-65.

[4] 趙宏峰，徐芳菲，郭禹彤.RP-HPLC測定益血合劑（無糖型）中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中國醫(yī)藥指南，2015，13（31）：31-33.

[5] 賀康洪，潘志浩，張漢道.HPLC法同時測定歸芪消白膠囊中二苯乙烯苷和丹皮酚的含量[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報，2015，31（3）：235-237.

[6] 太成梅，張清波.HPLC法測定蒲參膠囊中2,3,5,4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2014，15（5）：357-359.

[7] 王紅，楊慈海，宋軍.高效液相色譜法測定補腦安神片中二苯乙烯苷含量[J].中國藥業(yè)，2016，25（16）：72-74.

Determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules by HPLC

FAN Jin-zhao1, DING Xiao-fang2, BAI Lin1, LI Xin1(1. Department of Preparation Center, PLA General Hospital, Beijing 100853, China; 2. Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China)

Objective:To establish a method for determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules.Methods:Diamonsil C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) was used with a mobile phase consisting of acetonitrile-water (16 : 84). The detection wavelength was 320 nm with a fl ow rate of 1.0 mL·min-1. Column temperature was 35 ℃.Results:The 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside had a good linear relationship within the range of 3.767 4 – 25.116 0 μg·mL-1(r= 1). The average recovery was 99.80%, RSD was 1.47% (n= 9).Conclusion:This method is simple, accurate and high sensitive, which can be used for content determination of 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside inXinshenangranules.

HPLC;Xinshenangranules; 2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D- glucoside; Content determination

R917

A

1672 – 8157(2017)04 – 0209 – 03

2016-12-20

2017-03-10）

李欣，女，副主任藥師，研究方向：新藥研發(fā)，藥品質(zhì)量控制。E-mail：doublelixin@126.com

范金釗，男，藥師，研究方向：藥物分析與藥品質(zhì)量控制。E-mail：fanjinzhaozy@163.com