艾灸對兔膝骨性關節炎模型血清IL-1β、COX-2、COMP表達的影響

姚 暢 程 珂 趙 玲 沈雪勇

1 浙江中醫藥大學附屬第三醫院 浙江 杭州 310005 2 上海中醫藥大學針灸推拿學院 上海 201203

艾灸對兔膝骨性關節炎模型血清IL-1β、COX-2、COMP表達的影響

姚 暢1程 珂2趙 玲2沈雪勇2

1 浙江中醫藥大學附屬第三醫院 浙江 杭州 310005 2 上海中醫藥大學針灸推拿學院 上海 201203

艾灸 膝骨關節炎 IL-1β COX-2 COMP 兔

膝骨性關節炎是一種常見的中老年疾病，膝關節的疼痛和功能障礙嚴重影響了患者的生活。近年來，國內外對膝骨性關節炎的治療進行了大量臨床研究，報道的治療手段包括休息、物理治療、藥物治療、支具、運動療法和手術等。目前臨床常用非類固醇消炎止痛藥（NSAID），通過這類藥物抗炎、止痛和解熱作用來進行治療。但是西藥有較大的副作用，長期服用也會對患者的胃腸功能造成影響。膝骨性關節炎在中醫屬“痹證”范疇，其病機以肝腎虧虛為本，感受風、寒、濕外邪，氣血瘀滯為標。中醫艾灸可溫通經絡，驅散寒邪，行氣活血，消瘀散結，在治療膝骨性關節炎方面有其獨特的療效和優勢。IL-1β、COX-2、COMP在膝骨性關節炎的病理過程中均起到了重要作用。IL-1β作為一種致炎細胞因子，在炎性疼痛中主要介導炎性痛敏。COX-2在正常組織細胞內的活性極低，當受到誘導后大量產生，它通過對前列腺素（PG）合成的促進作用，介導炎癥和疼痛等反應。C

OMP是軟骨中非膠原蛋白的主要成分,作為一種軟骨代謝標記物，軟骨的損傷、修復和代謝變化均可能影響COMP的表達水平。本實驗通過研究艾灸對兔膝骨性關節炎模型血清中IL-1β、COX-2、COMP表達的影響，探討艾灸治療膝骨性關節炎的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：健康新西蘭大耳白兔22只，雌雄不限，體重2.0～2.5kg,由上海中醫藥大學動物實驗中心提供[SCXK（滬）2009-0069]，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司[動物合格證號SCXK（滬）2009-0018]。

1.2 實驗材料與試劑：紙管貼穴灸(泰州市灸療研究所提供)；主要試劑：采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測IL-1β、COX-2、COMP，試劑盒（上海活樂生物科技有限公司提供），3℅戊比妥鈉（中國醫藥集團上海化學試劑公司提供，批號：F20020915），慶大霉素（上海哈靈生物科技有限公司提供，批號：HL130326），95%酒精（上海哈靈生物科技有限公司提供，批號：B1227012）。

1.3 實驗儀器：酶標儀：芬蘭（Labsystems Mul tiskan MS），型號：352型，洗板機：芬蘭（Thermo Labsystems），型號：AC8，離心機：微量高速離心機（國產），型號：TG16W，培養箱：隔水式恒溫培養箱（國產），型號：GNP-9080型。

1.4 實驗方法：分述如下。

1.4.1 動物造模及分組：將22只健康白兔隨機分組，正常對照組6只，艾灸組和模型組均8只。其中正常對照組不做任何造模處理。艾灸組、模型組均采用Hul th骨關節炎動物模型法[1]造模。將兔用3℅戊比妥鈉(30mg/ kg)靜脈麻醉，仰臥固定于手術臺。右膝關節局部脫毛、備皮、消毒、鋪洞巾，取膝關節內側縱切口，切斷內側副韌帶，并剪斷2-3mm,從髕韌帶內側切口進入關節腔，切斷前交叉韌帶，止血、沖洗關節腔,抽屜實驗陽性后表明前交叉韌帶已離斷，逐層縫合。術后傷肢不予固定，置于標準動物飼養籠中自由活動及進食,手術后每只肌注慶大霉素0.5ml[2]，每日1次，連續3天。術后1周傷口愈合，驅趕兔每天活動30分鐘，6周后可獲得OA模型。

1.4.2 干預方法：造模成功后開始進行分組處理：艾灸組將兔置于固定器中，右側膝關節外側局部剪毛，將紙管貼穴灸黏貼于兔犢鼻穴，點燃施灸，燃盡后再黏再灸。施灸過程中觀察兔的反應，防止其活動而艾炷脫落。每次2壯，隔日1次，每周3次，連續治療4周。模型組將兔置于固定器中，右側膝關節外側局部剪毛，將紙管貼穴灸黏貼于兔犢鼻穴，不點燃，20分鐘后取下。隔日1次，每周3次，連續治療4周。正常對照組不造模，不治療。單籠飼養，常規飲食。

1.4.3 標本采集：4周后抽取三組兔耳緣靜脈血5ml，將采到的血液放在離心管里，盡量避免晃動，不要蓋緊以防溶血，在室溫下靜置2小時，3500轉離心10分鐘后取血清，分裝試管后置于-80℃冰箱中冷藏待測。采用酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測血清中IL-1β、COX-2、COMP的含量。ELISA法即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術，該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速、靈敏、簡便及易于自動化操作等優點。參照ELISA試劑盒使用說明書,以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,在坐標紙上繪出標準曲線,根據樣品的OD值由標準曲線查出相應的濃度,再乘以稀釋倍數。

1.5 統計學處理：使用SPSS 19.0統計分析軟件進行統計分析，計量資料以Mean±SD表示，組間兩兩比較采用one-way ANOVA，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP表達結果比較:與正常對照組相比，模型組和艾灸組的血清IL-1β、COX-2、COMP含量均增高（P＜0.05）；與模型組相比，艾灸組血清IL-1β、COX-2和COMP含量均降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表達（±s）

表1 各組白兔血清IL-1β、COX-2、COMP的表達（±s）

注：與對照組比較,*P＜0.05；與模型組比較,＃P＜0.05。

組別空白組模型組低劑量組中劑量組高劑量組達英-35組SCF（ng/L）104.89±7.68 63.95±8.20★77.48±6.05 84.87±7.72▲91.45±9.92▲89.51±7.89▲例數9 9 9 9 9 9 INHB（ng/L）16.18± 6.62 29.08± 8.41★26.00±12.59 24.93± 8.22 18.27± 8.12▲28.30± 9.98

3 討論

膝骨性關節炎是一種以關節軟骨退化損傷、骨質增生為主要病變特點的退行性疾病，其病因非常復雜，可能與化學、生物、機械以及酶反應通路等因素有關。IL-1β、COX-2、COMP在其病理過程中均起到了重要作用。IL-1β大量存在于在OA軟骨組織中、上層軟骨細胞及基質中，可誘導基質金屬蛋白酶（MMPs）合成，并激活MMPs，同時抑制基質金屬蛋白酶抑制劑(TIMPs)的合成,使膠原蛋白的降解增加,通過促進軟骨細胞凋亡,抑制軟骨基質合成，最終導致關節軟骨進行性破壞[3-4]。IL-1β通過磷酸化JNK來激活c-Jun/AP-1、降低Sox9的水平(蛋白質或mRNA)，從而抑制透明軟骨特征性Ⅱ、Ⅳ型膠原的合成，促進具有纖維母細胞特性的Ⅰ、Ⅲ型膠原的合成，導致軟骨細胞變性，抑制軟骨細胞增殖和蛋白多糖的合成。另外，IL-1β還可促進軟骨細胞分泌PGE2參與關節的炎癥反應，刺激骨吸收及成骨細胞樣細胞增殖,導致關節骨、軟骨增生性變化。

COX-2是炎癥過程中一個重要的誘導酶，在生理狀態呈現低表達[5]，一旦受到細菌脂多糖(LPS)、炎癥細胞因子等刺激時，會主要在軟骨細胞、內皮細胞和巨噬細胞呈現高表達。COX-2促進軟骨細胞將花生四烯酸轉化成PGE2，軟骨細胞和滑膜細胞分泌PGE2和膠原酶增加，加速軟骨基質中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的分解，并抑制其合成，誘導關節軟骨免疫反應增強，對膝關節軟骨組織造成破壞[6]。

膝骨性關節炎可歸于中醫學“痹證”“骨痹”“筋痹”等范疇，本病與年老體衰、長期勞損、外感風寒濕邪有關。《素問·痹論篇第四十三》云：“風寒濕三氣雜至，合而為痹也。”《景岳全書》云：“蓋痹者閉也，以氣血為邪所閉，不得通行而病也。”強調了膝骨性關節炎發病中寒凝、血瘀、氣滯的病機。灸法是以艾為主要施灸材料，點燃后在體表穴位或病變部位燒灼、溫熨，借其溫熱、藥物的刺激作用，以治療疾病的一種方法。灸法是針灸療法的一個重要組成部分。《靈樞·官能》明確指出“針所不為，灸之所宜”。《醫學入門》說：“凡病藥之不及，針之不到，必須灸之”。艾灸能溫通經絡、散寒逐痹，使“不通則痛”為“通則不痛”，故臨床上常以艾灸來治療膝骨性關節炎，并顯現出較理想的療效。艾灸作為中醫外治法之一，具有溫經通絡，活血消瘀，通痹散結之功效，能有效地改變血液的高濃、高聚、高黏狀態[7]。艾灸治療膝骨關節炎的療效已得到了大量臨床研究的證實[8],本實驗是對其治療機制機理的研究。實驗結果顯示，與正常對照組相比，模型組和艾灸組的血清IL-1β、COX-2、COMP的含量均要增高，其差異具有統計學意義（P＜0.05），與模型組相比，艾灸組血清IL-1β、COX-2和COMP的含量均要降低，其差異具有統計學意義（P＜0.05）。說明艾灸可降低血清IL-1β、COX-2和COMP含量，從而減輕炎癥反應，緩解疼痛，減少關節軟骨的損傷，達到一定的治療膝骨性關節炎的效果。今后將考慮擴大樣本量，進一步研究艾灸治療膝骨性關節炎的作用機制。

[1]Hul th A,Lindberg L,Telhag H.Experimental osteoar thritis in rabbits prel iminary repor t[J].Acta Orthopaedica,1970,41(5)：522.

[2]謝希，高潔生.骨關節炎動物模型研究進展[J].醫學綜述,2005,11（1）：67-69.

[3]陳萬軍，鮑同柱.白介素-1家族與骨性關節炎研究進展[J].重慶醫學,2011，40（31）：3198-3200.

[4]劉新，黃文瑤，李衛國,等.TLR-4、IL-1與膝骨關節炎相關性的臨床研究[J].中華關節外科雜志,2013,7(4):481-485.

[5]羅劍剛,李慧,楊聰嫻.COX-2選擇性抑制劑治療疼痛的研究進展[J].中國疼痛醫學雜志,2012,18（2）：66-69.

[6]金榮忠,談國明,胡輝東.COX-2在膝關節骨性關節炎軟骨中表達及臨床意義[J].生物骨科材料與臨床研究,2010,7 (6)：18-20.

[7]張陽春，李秀彬.“雙固一通”隔物溫和灸治療膝骨性關節炎30例臨床觀察[J].浙江中醫雜志,2015,50(5)：382.

[8]謝洪武，陳日新，徐放明.艾灸治療膝骨性關節炎的臨床概況[J].中華中醫藥雜志，2012,27（9）：2374-2377.

2017-05-21