枳椇子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子表達(dá)的影響

姚侃男 馮彩珠 朱肖鴻

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310018

中藥研究

枳椇子對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子表達(dá)的影響

姚侃男1馮彩珠1朱肖鴻2#

1 浙江中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 浙江 杭州 310053 2 浙江省中醫(yī)院 浙江 杭州 310018

枳椇子 RAW264.7巨噬細(xì)胞 脂多糖 TLR4

實(shí)驗(yàn)組在先期研究中已得到枳椇子可以減輕酒精灌胃大鼠炎癥及脂肪變[1]。本文在先期研究基礎(chǔ)上，探索枳椇子對(duì)LPS作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的影響及其相關(guān)機(jī)制，明確枳椇子對(duì)腸源性內(nèi)毒素血癥的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑：枳椇子顆粒劑購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司；LPS購(gòu)自Sigma公司；RAW264.7；30%丙烯酰胺（29:1）、RIPA組織細(xì)胞快速裂解液、過(guò)硫酸銨、SDS、Tris購(gòu)自Solarbio公司；BCA蛋白定量試劑盒、SYBR Green PCR試劑盒購(gòu)自Thermo公司；蛋白預(yù)染Marker、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；Rabbit anti TLR4 Polyclonal antibody（96kD）、Rabbit anti p65（65kD）購(gòu)自Proteintech公司；p-p65（65kD）購(gòu)自Aff inity公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase GAPDH）（37kD）購(gòu)自CST公司；羊抗兔HRP標(biāo)記二抗、驢抗山羊HRP標(biāo)記二抗、羊抗鼠HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自碧云天公司；NC膜、發(fā)光液購(gòu)自Mi l lipore公司；PBS磷酸鹽緩沖液購(gòu)自上海長(zhǎng)島抗體診斷試劑公司；脫脂奶粉購(gòu)自BD分裝公司；Tween-20購(gòu)自Amresco公司；Trizol購(gòu)自Invit rogen公司；DEPC處理水購(gòu)自基爾頓生物；異丙醇、無(wú)水乙醇、氯仿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 主要儀器：TG-16M型低溫冷凍離心機(jī)購(gòu)自上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司；K30型渦旋振蕩器購(gòu)自青浦瀘西儀器廠；ABI-7300型Real-time檢測(cè)儀購(gòu)自ABI公司；PRO200型電動(dòng)勻漿儀購(gòu)自FLUKO公司；mini protean 3 cel l型電泳儀購(gòu)自BIO-RAD公司；PS-9型電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自大連競(jìng)邁科技有限公司；MK3型酶標(biāo)儀購(gòu)自芬蘭雷勃酶標(biāo)儀；P型移液器購(gòu)自吉爾森公司；HI1210型水浴鍋購(gòu)自Leica公司；Tanon-520型成像系統(tǒng)購(gòu)自Tanon公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：RAW264.7用含10%胎牛血清，1%雙抗(青鏈霉素混合液)的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 Western Blot法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化，顯微鏡下計(jì)數(shù)，按照每孔50萬(wàn)的密度鋪入6孔板中，每組細(xì)胞每塊板接種3個(gè)同樣的孔作為復(fù)孔。每塊板設(shè)置4個(gè)組，處理24h后，提取總蛋白，采用BCA蛋白定量法檢測(cè)各組細(xì)胞蛋白濃度，PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，膜上蛋白檢測(cè)，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗37℃孵育1h，ECL顯色。根據(jù)先期試驗(yàn)結(jié)果，枳椇子濃度取0.8mg/ml。分組見(jiàn)表1。2.3 qRT-PCR法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-βmRNA的表達(dá)：采用Trizol試劑提取總RNA，操作流程按試劑盒進(jìn)行。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，具體見(jiàn)表2。合成cDNA第一條鏈，取2μLcDNA為模板，在25μL反應(yīng)體系中進(jìn)行r tPCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95℃變性15s，60℃退火45s，循環(huán)40次。據(jù)采用儀器自帶軟件分析：ABI Prism 7300 SDS Sof tware。

表1 細(xì)胞分組

3 結(jié)果

3.1 枳椇子提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影響：由圖1及圖2可知，相比空白對(duì)照組，LPS未處理時(shí)，枳椇子對(duì)TLR4、p-p65、p65蛋白含量無(wú)顯著影響；而LPS處理后，單純的LPS處理組TLR4、pp65含量增加，p65蛋白含量無(wú)顯著變化；與單純的LPS處理組相比，枳椇子處理組的TLR4、p-p65蛋白含量減少，p65蛋白含量無(wú)顯著變化。

表2 引物序列

圖1 Western blot檢測(cè)TLR4、p-p65、p65條帶圖譜

圖2 枳椇子提取液對(duì)巨噬細(xì)胞中TLR4、p-p65、p65蛋白含量的影響

3.2 枳椇子提取液對(duì)RAW264.7細(xì)胞中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)的影響：由圖3可知，相比空白對(duì)照組，LPS未處理時(shí)，枳椇子對(duì)TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響；而LPS處理后，單純的LPS處理組上調(diào)TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)，下調(diào)IL-10mRNA表達(dá)；與單純的LPS處理組相比，枳椇子處理組的TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，上調(diào)IL-10mRNA表達(dá)。

圖3 枳椇子對(duì)巨噬細(xì)胞組中TLR4、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)的影響

4 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞增加TLR4、p-p65蛋白表達(dá)，上調(diào)促炎因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)，抑炎因子IL-10的含量減少；枳椇子在0.8mg/ml時(shí)則可減少TLR4、p-p65含量及抑炎因子如TLR4、IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，上調(diào)IL-10mRNA表達(dá)，其機(jī)制可能與枳椇子能調(diào)節(jié)抑炎因子與促炎因子的失衡狀態(tài)相關(guān)。我們也可從中得出，枳椇子可調(diào)節(jié)肝內(nèi)免疫，同時(shí)對(duì)改善肝臟炎癥有明顯確切的療效。此后，我們也將進(jìn)一步進(jìn)行枳椇子相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究，為臨床使用枳椇子治療酒精相關(guān)性肝病提供依據(jù)。

[1]陳春曉,朱肖鴻.酒精性肝炎大鼠模型建立及枳椇子的干預(yù)作用[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,17（5）：285-287.

2017-04-10

# 通訊作者：朱肖鴻，E-mai l：zxh922@sina.com