新型透明質酸改性的CS—g—PEI/pDNA的構建及介導轉染軟骨細胞的體外研究

陳明偉+范彬彬+盧華定

[摘要] 目的 探討新型透明質酸改性的聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）納米粒作為治療骨關節炎（OA）的可行性。 方法 通過復凝聚法制備成CP/pDNA納米粒，然后通過巰基的原位交聯與巰基化的透明質酸（HA-SH）形成交聯網絡，從而合成HA-CP/pDNA納米粒；透射電鏡觀察納米粒形貌，馬爾文粒度分析儀分析其不同構成比（HA-SH∶CP）時的粒徑、表面電位等；凝膠電泳阻滯實驗檢測CP/pDNA的結合力；CCK-8細胞毒性實驗檢測該基因載體的細胞毒性；以HA-CP/pDNA納米粒、裸pDNA、CS/pDNA、CP/pDNA納米粒、LipofectamineTM2000轉染軟骨細胞，熒光顯微鏡、流式細胞儀檢測基因轉染效率。 結果 ①HA-CP/pDNA納米粒呈較均一的球形，并隨HA-SH∶CP質量比的增加，粒徑先減小后增大，表面電位電荷逐漸降低。②HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞毒性遠低于LipofectamineTM2000（P < 0.05）。③HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞轉染率較CP/pDNA、CS/pDNA納米粒大大提高（P < 0.05）。④大量游離HA導致HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的轉染效率下降。 結論 HA-CP/pDNA納米粒具有更強的DNA保護能力，對軟骨細胞毒性小，轉染效率高，并且對軟骨細胞具有一定的靶向性。

[關鍵詞] 透明質酸；CP/pDNA納米粒；基因治療；軟骨細胞

[中圖分類號] R318.08 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）07（c）-0004-06

[Abstract] Objective To investigate the feasibility of hyaluronic acid modified CS-g-PEI/pDNA nanoparticles and mediated gene transfection against osteoarthritis. Methods CP was engaged with pEGFP into nanopartricles by using complex coaceration method and then covering the CP/pDNA with HA-SH， HA-SH forming disulfide cross-linked gene complex， and on the surface of the CP/pDNA form cross-linked network with HA， synthesis HA-CP/pDNA； the morphy of nanoparticle was obtained by TEM， the particle size and surface potential were measured by Malvern particle size analyzer； The pDNA binding ability with CP and the influence of HA-SH on CP were evaluated by gel retardation assay； the cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles was evaluated by CCK-8 assays； HA-CP/pDNA nanoparticles， nake pDNA， CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles and lipofectamineTM2000 transfected chondrocytes， the transfection efficiency was measured by flurescence microscope， flow cytometry. Results ①TEM showed that the nanoparticles were well-formed spherical shapes with compact structure， and increased with HA-SH∶CP weight ratio increasing， nanoparticle sizes decreased firstly then increased， the surface potentials gradually decrease. ②The cytotoxicity of HA-CP/pDNA nanoparticles had lower cellular toxicity than LipofectamineTM2000 （P < 0.05）. ③The HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency for chondrocytes was highly improved compared to CS/pDNA， CP/pDNA nanoparticles （P < 0.05）. ④Free HA decrease HA-CP/pDNA nanoparticles transfection efficiency notably. Conclusion HA-CP/pDNA has lower cytotoxicity and higher transfection efficiency， and it has the ability of targeting chondrocytes.

[Key words] Hyaluronic acid； CS-g-PEI/pDNA； Gene therapy； Chondrocyte

在基因治療中，理想的基因載體應具有較高的轉染率、良好的靶向性等安全性特點[1]。病毒載體靶向特異性差，存在高免疫原性、致癌性等缺陷[2-3]。而非病毒基因載體因其低免疫性、較高靶向性及材料可修飾性，成為當下研究熱點[4-6]。聚乙烯亞胺-殼聚糖/DNA（CS-g-PEI/pDNA）納米粒能有效保護質粒DNA免受核酸酶降解，對關節軟骨細胞有較高的轉染效率[7]；HA因其高度的黏彈性、可塑性、優良的生物相容性等特點，被廣泛應用于臨床包括骨關節炎（OA）的治療。本研究創新性地將巰基化的透明質酸（HA-SH）與CS-g-PEI/pDNA納米粒相結合形成透明質酸改性的CS-g-PEI/pDNA（HA-CP/pDNA）納米粒。通過理化特征檢測及體外基因轉染軟骨細胞實驗等，探討其作為治療骨關節炎靶向基因載體的可行性，為開發出安全高效的治療OA的新型靶向基因治療藥物提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

新西蘭3周齡白兔3只，體重0.5～0.6 kg，均為雄性，購置于廣東省醫學實驗動物中心（合格證號：SCXK 2008-0002）。

1.2 主要試劑及儀器

殼聚糖（CS，50 kD，脫乙酰度85%～90%）、聚乙烯亞胺（PEI，1.8 kD）、Ⅱ型膠原酶（Sigma-Aldrich，美國）；pEGFP、DH5α感受態細胞、LipofectamineTM2000、CCK-8（Invetrigen，美國）；高糖DMEM、PBS、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶/EDTA（Gibco，美國）；青霉素G鈉、兩性霉素B（廣州杰特偉公司，中國）；HA（10 kD，山東正大福瑞達生化有限公司，中國）；去內毒素質粒大提試劑盒（Omega）；流式細胞儀（BD FACSCalibu）；磁共振儀（ARX400，Bruker，德國）；馬爾文ZS90粒度儀（馬爾文儀器公司，英國）；倒置熒光顯微鏡（Nikon-TE2000-U，日本）。

1.3 方法

1.3.1 pDNA準備 將pEGFP經E.coli DH5α細胞在含卡那霉素的LB培養基上進行增殖。利用Omega質粒大提試劑盒進行質粒的提取、純化。所得質粒pEGFP經核酸蛋白分析儀檢測純度與濃度，-30℃保存備用。

1.3.2 HA-CP/pDNA納米粒的制備 參照Jiang等[8]和Pezzoli等[9]的方法進行CP的合成，HA-SH的合成參考Jin等[10]和He等[11]的方法。合成后的樣品溶于D2O/CD3COOD（11∶1），通過1HNMR檢測，得到核磁譜圖，核磁軟件MestReNova進行分析。

將1 μg/μL CP按一定質量比與pDNA輕柔混合，靜電吸附[12]作用制得CP/pDNA納米粒溶液。將1 μg/μL HA-SH水溶液滴至CP/pDNA（pH = 5.5）中，納米粒表面形成HA涂層，介質pH調至7.4，通過氧氣中巰基的原位交聯形成基因復合物組裝體，即制得HA-CP/pDNA納米粒。

1.3.3 HA-CP/pDNA納米粒形貌特征檢測及表面電荷測定 無水乙醇分散HA-CP/pDNA納米粒溶液，滴于銅網放置30 min，真空干燥過夜，磷鎢酸負染后透射電鏡觀察。馬爾文ZS90粒度儀測量HA-CP/pDNA納米粒粒徑及表面Zeta電位。

1.3.4 凝膠電泳阻滯實驗 取裸pDNA溶液和不同質量比的CP/pDNA納米粒溶液（CP∶pDNA為1∶20、1∶8、1∶6、1∶4、1∶2、1∶1），進行1%瓊脂糖凝膠電泳。配制不同質量比的HA-SH：CP/pDNA（1∶5、1∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1）溶液并將其加入到CP/pDNA中觀察HA-SH與CP/pDNA的濃縮能力，電泳并分析結果。

1.3.5 HA-CP/pDNA納米粒的細胞毒性試驗 細胞毒性試驗采用CCK-8法進行測定[21]，計算細胞存活率。計算公式=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%，計算結果后對數據進行統計學分析。

1.3.6體外轉染軟骨細胞 重新制備CS/pDNA、CP/pDNA（CP：pDNA質量比為5∶1）、HA-SH/pDNA的納米粒溶液，裸pDNA為陰性對照組，LipofectamineTM2000為陽性對照組。取第3代軟骨細胞以1×105/孔接種到24孔板中，每孔預先加入500 μL完全培養基，培養24 h，移除培養基；PBS輕洗2遍，加入500 μL無FBS、雙抗的高糖DMEM培養基培養30 min后除去培養基；將不同納米粒溶液、裸pDNA以2 μg/孔pDNA加入500 μL不含FBS、雙抗的高糖DMEM培養基中。LipofectamineTM2000轉染則以每孔0.6 μg pDNA∶1.8 μL LipofectamineTM2000加入培養孔中。培養4 h后，更換完全培養基（500 μL/孔）培養48 h，倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達情況。轉染48 h后，0.25%的胰蛋白酶/EDTA消化3 min，1000 r/min 5 min，PBS重懸，流式細胞儀定量檢測綠色熒光蛋白表達率。在轉染HA-CP/pDNA納米粒之前，細胞培養孔中加入過量HA，分別為HA-CP/pDNA納米粒中HA-SH的10、20、40倍，流式細胞儀定量檢測轉染效率。

1.4 統計學方法

采用統計軟件SPSS 13.0對數據進行分析，正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以率表示，采用χ2檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CP和HA-SH的核磁檢驗

圖1所示，CS在化學位移δ = 3.0×10-6～4.1×10-6，PEI在化學位移δ = 2.1×10-6～3.5×10-6為其特征質子峰。圖1a表明，CS和PEI成功進行了接枝反應，通過核磁計算接枝率為5.5%，圖2表明1HNMR圖譜中化學位移δ = 1.9×10-6處的信號峰為HA乙酰氨基甲基上的氫原子，化學位移δ = 2.5×10-6～2.7×10-6處為HA-SH中半胱胺亞甲基上的質子峰，表明HA巰基化成功[10，13]。采用Ellman試劑法[14]測定HA-SH中巰基的接枝率約為4.2%。

2.2 HA-CP/pDNA納米粒形態特征及表面電荷

圖3所示，HA-SH∶CP質量比為10∶1時經透射電鏡下觀察，HA-CP/pDNA納米粒形態表面光滑的球形，粒徑在100～300 nm之間，分散度良好。納米粒的粒徑隨HA-SH∶CP質量比增加先減小后增大，Zeta電位逐漸減小（圖4）。HA-SH∶CP質量比為5∶1時，粒徑最小為（255.7±11.4）nm。HA-SH∶CP質量比大于5∶1后，電位越小，納米粒經越大，甚至在質量比為20∶1時，納米粒徑達到700 nm以上。

2.3 凝膠電泳阻滯實驗結果

由圖5a可知，裸pDNA跑出加樣孔，而CP/pDNA納米粒隨著CP與pDNA質量比的增高后，跑出的條帶越來越弱，在CP∶pDNA為1∶2時，能阻滯pDNA向陽極移動，使pDNA條帶消失。加入HA-SH后（CP∶pDNA為1∶4），圖5b可觀察到隨著加入HA-SH量的增加，原有跑出的pDNA條帶逐漸消失。

2.4 細胞毒性實驗

HA-CP/pDNA納米粒與CP/pDNA納米粒對軟骨細胞活力差異無統計學意義（P > 0.05）。在針對軟骨細胞的細胞毒性實驗中，實驗組的HA-CP/pDNA納米粒和的CP/pDNA納米粒濃度增至40 μg/mL時細胞的存活率也在90%以上，顯著高于對照組（5 μg/mL的LipofectamineTM2000），差異有高度統計學意義（P < 0.01）。HA-CP/pDNA納米粒，軟骨對細胞毒性均顯著低于LipofectamineTM2000（P < 0.01），后者的細胞存活率低于60%。見圖6。

2.5 體外基因轉染實驗結果

2.5.1 不同載體體外轉染軟骨細胞和滑膜細胞的比較 HA-CP/pDNA納米粒組與LipofectamineTM2000組熒光強度最強，CP/pDNA和CS/pDNA納米粒組有較多細胞表達綠色熒光蛋白，裸pDNA組只有極個別細胞表達弱的綠色熒光，四組之間軟骨細胞的轉染效率差異有統計學意義（P < 0.05）。見圖7。流式細胞儀檢測HA-CP/pDNA、CP/pDNA、CS/pDNA、裸pDNA和LipofectamineTM2000組48 h轉染率分別為（26.46±1.76）%，（16.34±1.26）%，（6.78±0.62）%，（0.32±0.06）%和（28.26±2.07）%（n = 6，P < 0.05）（圖8，封三）。HA-CP/pDNA納米粒組與裸pDNA、CP/pDNA納米粒組、CS/pDNA納米粒組在轉染率差異有高度統計學意義（P < 0.01），而與LipofectamineTM2000組差異無統計學意義（P > 0.05）。

2.5.2 HA對HA-CP/pDNA轉染軟骨細胞效率的影響 隨著轉染前加入HA量的增加，HA-CP/pDNA對軟骨細胞的轉染效率逐漸降低，當50倍于HA-CP/pDNA中HA-SH的量時，轉染效率降低顯著（P < 0.05）。見圖9。

3 討論

基因治療中理想的基因載體應具有生物相容性好、毒性低、轉染效率高等特點[15-16]。軟骨細胞表面存在的CD44膜蛋白受體是最常見的透明質酸受體[17-18]。本實驗通過HA與CD44受體特異性結合，實現靶向基因轉染，提高CP對軟骨細胞的轉染效率。本實驗將巰基化的HA通過氧氣中巰基的原位交聯[11]，在CP/DNA表面形成帶HA交聯網絡，可促使聚合物更穩定，通過HA-CD44作用達到對軟骨細胞的靶向基因轉染。核磁結果證明了CP與HA-SH的合成是成功的。隨著HA-SH∶CP質量比的增加納米粒的粒徑先減小后增大，Zeta電位逐漸減小。粒徑先減小后增大主要是因為，在一定范圍內HA-SH∶CP質量比≤10∶1時，加入的HA-SH通過氧氣中巰基的原位交聯，在CP/pDNA納米粒表面形成HA交聯網絡，對納米粒進一步壓縮，使得聚合物更加穩定，粒徑更小；粒徑增大是由于隨著HA-SH加入量的增加，過量的HA-SH使得納米粒表面電荷越來越小；當HA-SH∶CP質量比≥20∶1時，納米粒的Zeta電位趨于中性，而納米粒在溶液中維持形態首先要聚合物結合緊密，其次需要足夠的同性電荷斥力來保持納米粒之間的距離，當電荷逐漸減小時，納米粒表面電荷之間靜電作用力越來越弱，使得納米粒溶液極不穩定，納米粒相互聚集[19]。

在凝膠阻滯實驗中，隨著CP∶pDNA質量比的提高，凝膠電泳跑出的pDNA的條帶越來越弱，說明CP：pDNA聚合物結合pDNA的能力越來強，而游離出來的pDNA也越來越少。當質量比為1∶2時，已無明顯的條帶跑出，說明此時聚合物完全包裹pDNA。在CP/pDNA（1：4）的復合物中加入HA-SH可看到，隨著HA-SH的增加，原有跑出的條帶逐漸減弱，當HA-SH∶CP/pDNA質量比為10∶1時，已無條帶跑出，這也證實了HA-SH對CP/pDNA納米粒具有進一步壓縮作用，使納米粒更加穩定。CCK-8細胞毒性實驗檢測顯示，即使HA-CP/pDNA納米粒濃度達到至40 μg/mL，細胞的存活率也能達到90%以上，其細胞毒性遠小于LipofectamineTM2000。可能因為HA具有良好的生物相容性，且合成的CP中引入的是小分子的PEI（1.8 kD），所帶表面電荷較低，CP細胞毒性較小。因此HA-CP/pDNA納米粒可作為一種安全的基因載體應用于OA的基因治療。

由體外基因轉染實驗結果可知，HA-CP/pDNA納米粒轉染效率明顯高于CP/pDNA、CS/pDNA，主要因為：①納米粒載體進入細胞方式的多樣化。在HA-SH對CP/pDNA進行修飾后，形成的納米粒一方面通過HA與軟骨細胞表面的CD44受體特異性結合，利用受體介導的細胞內吞方式進入細胞；另一方面，在HA-SH∶CP質量比為10∶1時，納米粒表面仍帶有正電荷，可與胞膜上有帶負電荷的脂肪酸結合，使得納米粒沉積于細胞表面從而被內吞進入細胞。②HA與CD44的相互作用引發細胞內的信號傳導促進轉染效率的提高[20]。③HA與CP/pDNA的結合方式使得HA-CP/pDNA納米粒具有較高穩定性。HA-CP/pDNA納米粒進入細胞后，在GSH作用下，二硫鍵還原成SH，納米粒表面交聯網絡破壞，HA-CP/pDNA解離，釋放DNA，細胞分裂時，DNA有更多的機會進入細胞核表達目的基因。④HA可作為一種基因轉錄活化劑[21]，提高HA-CP/pDNA納米粒的基因轉染效率。在轉染之前加入過量的HA，HA-CP/pDNA的轉染效率明顯降低[22]，這是因為游離的HA與軟骨細胞表面的受體CD44結合[15，23]，競爭性的抑制了HA-CP/pDNA中HA與CD44的結合，進一步說明了HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的靶向作用。轉染早期HA-CP/pDNA的轉染效率低下，而細胞轉染48 h后，轉染效率明顯升高，這是因為HA-CP/pDNA納米粒經細胞膜內吞作用進入細胞后，需要在GSH的作用下首先降解HA-SH在CP/pDNA表面形成的二硫鍵網絡后才能逐漸釋放出所攜帶的DNA，因其緩控釋性能，大大增強了其在體內關節疾病中的應用潛能。

實驗通過復凝聚法構建了CP/pDNA納米粒，再在其表面覆蓋HA-SH，通過氧氣中巰基的原位交聯形成基因復合物組裝體，制得HA-CP/pDNA納米粒，并對其理化性質及對pDNA的保護能力進行檢測；HA-CP/pDNA納米粒與軟骨細胞相容性良好，在有效的轉染濃度范圍內，CCK-8試驗表明其毒性遠遠低于LipofectamineTM2000，安全性可靠。HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞的轉染率較CS/pDNA、CP/pDNA高，與LipofectamineTM2000相當。HA-CP/pDNA納米粒對軟骨細胞具有一定的靶向性，隨著配體HA的引入，能大幅提高CP、CS載體對關節軟骨細胞的轉染效率，同時減少毒副作用，因此HA-CP/pDNA納米粒可作為治療OA等關節疾病的一種非病毒基因載體。本實驗雖然證實了HA-CP/pDNA納米粒具有一定的靶向性并可提高軟骨細胞體外基因轉染的效率。但此研究尚停留在細胞分子水平，對于HA-CP/pDNA納米粒在體內的體內的轉染效果及有無不良反應，尚待進一步研究。

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