信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3在紫鉚因誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡作用的研究

陳少陽(yáng)++++++岳宏林++++++劉旭

[摘要] 目的 探討紫鉚因（BTN）誘導(dǎo)人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在該過(guò)程發(fā)揮的作用。 方法 常規(guī)培養(yǎng)A549細(xì)胞，給予0、25、50 μmol/L的BTN處理24 h，BTN 0 μmol/L為對(duì)照組，檢測(cè)各組細(xì)胞活力、凋亡、遷移、ROS含量及Caspase-3活性，STAT3通路（p-STAT3、STAT3）和凋亡相關(guān)蛋白（Bcl-2、Bax）含量變化。N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）5 mmol/L特異性抑制活性氧（ROS）生成后，BTN（0、50 μmol/L）處理細(xì)胞24 h，重復(fù)上述檢測(cè)。建立裸鼠皮下腫瘤模型，腹腔注射BTN（2、4 mg/kg），對(duì)照組注射等體積PBS，明確BTN抗肺腺癌的作用。 結(jié)果 與對(duì)照組相比，BTN（25、50 μmol/L）有效抑制A549細(xì)胞活力和遷移（P < 0.05），促進(jìn)凋亡（P < 0.05），顯著增加ROS含量及Caspase-3活性（P < 0.05）。Western blot結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，BTN處理抑制p-STAT3和Bcl-2表達(dá)（P < 0.05），上調(diào)凋亡蛋白Bax表達(dá)（P < 0.05）。相比BTN組，應(yīng)用NAC后則抑制BTN促ROS生成（P < 0.05），同時(shí)拮抗了BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用（P < 0.05）。在體研究發(fā)現(xiàn)，相比對(duì)照組，BTN處理劑量依賴(lài)地抑制腫瘤生長(zhǎng)，抑制STAT3磷酸化（P < 0.05）。結(jié)論 BTN可有效抑制肺腺癌A549細(xì)胞活力、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，此作用可能與促ROS生成進(jìn)而抑制STAT3磷酸化有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 紫鉚因；肺腺癌；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3；活性氧；凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)] R734.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）07（c）-0029-05

[Abstract] Objective To investigate the pro-apoptotic effect of Butein （BTN） in lung adenocarcinoma A549 cells and the role of STAT3 signaling in this process. Methods A549 cells were cultured and treated with different concentrations of BTN （0， 25， 50 μmol/L） for 24 h. BTN 0 μmol/L was taken as the control group. The survival rate， apoptotic rate， cell migration， ROS generation， Caspase-3 activity were respectively detected after treatment. Western blot was used to detect expression of p-STAT3， STAT3， Bcl-2 and Bax. NAC 5 mmol/L was used to block the generation of ROS， then BTN treatment （0， 50 μmol/L） was implemented for further detection as mentioned. Besides， in vivo studies were also used to verify whether abdominal injection with BTN （2， 4 mg/kg） exerted anticancer activity， while the control group was injected with PBS. Results Compared with the control group， BTN （25， 50 μmol/L） treatment resulted in reduction of cell viability and migration （P < 0.05）， promotion of cell apoptosis （P < 0.05）， up-regulation of ROS and Caspase-3 levels （P < 0.05）. BTN treatment resulted in a significant down-regulation of p-STAT3 and Bcl-2， and up-regulation of Bax （P < 0.05）. Moreover， inhibition of ROS by NAC antagonized the anti-STAT3 phosphorylated and pro-apoptotic role of BTN on A549 cells （P < 0.05）. In vivo studies showed that compared the control group， tumor volume and p-STAT3 expression in nude mice were significantly reduced after BTN treatment （P < 0.05）. Conclusion BTN treatment effectively inhibits cell viability and promotes apoptosis in A549 cells， which may be related to the up-regulation of ROS level thus inhibiting STAT3 phosphorylation.

[Key words] Butein； Lung adenocarcinoma； STAT3； ROS； Apoptosis

紫鉚因（Butein，BTN）大量存在于漆樹(shù)等植物中[1]，具有顯著的抗腫瘤作用[1-5]。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）在多種腫瘤中呈現(xiàn)持續(xù)的激活（磷酸化）狀態(tài)[6-7]，上調(diào)活性氧（ROS）含量則抑制STAT3激活進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2，8-9]。關(guān)于BTN在肺腺癌中的作用尚未明確，本研究通過(guò)BTN作用于肺腺癌A549細(xì)胞系，觀察細(xì)胞活力、凋亡率、遷移能力及STAT3通路的變化，結(jié)合裸鼠種植瘤模型研究STAT3通路在BTN誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與材料

A549細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所。紫鉚因，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC），二甲基亞砜（DMSO），噻唑藍(lán)（MTT），2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA），DAPI購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Bcl-2，Bax和β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；STAT3，p-STAT3（Tyr705）購(gòu)自美國(guó)CST公司；二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Roche公司；ROS檢測(cè)試劑盒及Caspase-GloR3/7定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司。

1.2 BTN及NAC母液配制

BTN先以DMSO溶解為100 mmol/L母液，濾菌后4℃保存?zhèn)溆谩AC以去離子水稀釋為500 mmol/L母液，分裝濾菌后-20℃保存?zhèn)溆谩TN濃度和處理時(shí)間參考其他腫瘤中BTN相關(guān)研究及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，BTN 50 μmol/L處理24 h對(duì)A549細(xì)胞具有顯著的殺傷作用[4]。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

A549細(xì)胞用含10%胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2濕化孵箱中。細(xì)胞融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要把細(xì)胞接種于不同的培養(yǎng)板中。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)為兩部分，用無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基將BTN和NAC稀釋到目的濃度后，第一部分分組為對(duì)照組（0.1% DMSO）及25、50 μmol/L BTN分別處理的實(shí)驗(yàn)組；第二部分分組為對(duì)照組（0.1% DMSO），NAC 5 mmol/L，BTN 50 μmol/L以及NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L共處理的實(shí)驗(yàn)組，無(wú)血清DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后分別進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

每孔7×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)6個(gè)復(fù)孔，經(jīng)處理后洗滌3次。加入MTT試劑，37℃孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，加入DMSO原液，振蕩使結(jié)晶完全溶解，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值（490 nm）。細(xì)胞活力=各實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

制作細(xì)胞爬片，于4℃用4%的多聚甲醛固定10 min。PBS洗滌3次，0.1%的Triton X-100打孔10 min，PBS洗滌1次。嚴(yán)格按照TUNEL法試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。在共聚焦顯微鏡下觀察，其中凋亡細(xì)胞TUNEL染色后為綠色熒光，細(xì)胞核DAPI染色后為藍(lán)色熒光，隨意選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率=視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/視野內(nèi)總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞接種到6孔板，貼壁后在板底部劃三條橫線，用200 μL槍頭在每孔中劃一條縱線，PBS洗后于培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后測(cè)量劃痕寬度。

1.7 Caspase-3活性測(cè)定

以每孔4×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞處理結(jié)束后，收集并裂解提取細(xì)胞蛋白。之后每孔加入100 μL Caspase-GloR3/7工作液，室溫下避光孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（波長(zhǎng)405 nm）。Caspase-3活性=各實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.8 ROS含量測(cè)定

根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組處理后將細(xì)胞消化并懸浮于稀釋的DCFH-DA中，CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞2 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)設(shè)為485 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)設(shè)為530 nm）。ROS含量=各實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度×100%。

1.9 裸鼠皮下腫瘤接種及測(cè)量

裸鼠購(gòu)自斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)No.43004700032628）。將裸鼠按體重編號(hào)，按隨機(jī)區(qū)組法分為對(duì)照組、2 mg/kg BTN組、4 mg/kg BTN組，每組6只。取對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞，裸鼠肩部皮下注射接種9×106個(gè)細(xì)胞。接種后飼養(yǎng)于SPF環(huán)境。每天分別給予腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN處理，每隔3天測(cè)量裸鼠體重和腫瘤體積。第28天處死小鼠并取皮下腫瘤，通過(guò)Western blot檢測(cè)瘤體p-STAT3水平。

1.10 Western blot檢測(cè)

細(xì)胞或瘤體勻漿在裂解緩沖液中裂解，以12 000 r/min離心15 min。收集上清液，蛋白定量，高溫變性后，蛋白行SDS-聚丙烯凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過(guò)夜。洗膜后二抗孵育2 h，洗滌3次，電化學(xué)發(fā)光試劑顯影，并用軟件分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量（Bio-Rad，West Berkeley，California，USA）。結(jié)果以各組目的條帶灰度值與內(nèi)參作比后，再以對(duì)照組為100%進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

不同濃度BTN處理A549細(xì)胞24 h后，可見(jiàn)BTN使細(xì)胞變圓、收縮甚至脫落。相對(duì)于對(duì)照組，不同濃度BTN處理后細(xì)胞活力分別下降到（72.4±5.6）%、（54.2±7.1）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖1。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，不同濃度BTN（24 h）可以有效誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[對(duì)照組：（2.1±2.44）%，BTN 25 μmol/L：（25.4±6.10）%，BTN 50 μmol/L：（50.3±6.40）%]，且呈濃度依賴(lài)性（P < 0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3 細(xì)胞遷移能力的影響

梯度濃度處理A549細(xì)胞24 h，細(xì)胞間距分別擴(kuò)大到對(duì)照組的（1.46±0.13）、（1.85±0.23）倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4 ROS含量及Caspase-3活性測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組相比，不同濃度BTN可以使A549細(xì)胞ROS含量增加[（185.6±21.8）%、（289.2±26.5）%]，Caspase-3活性升高[（194.3±24.1）%、（295.6±25.1）%]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖4。

2.5 Western blot檢測(cè)結(jié)果

不同濃度BTN處理A549細(xì)胞24 h后，Western blot檢測(cè)STAT3和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，BTN處理組細(xì)胞Bax表達(dá)上升，p-STAT3和Bcl-2的表達(dá)下降，且BTN濃度越高變化越明顯（P < 0.05）；但STAT3表達(dá)無(wú)明顯改變（P > 0.05）。見(jiàn)圖5。

2.6 應(yīng)用NAC抑制A549細(xì)胞ROS生成后各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果

2.6.1 細(xì)胞活力及ROS含量測(cè)定結(jié)果 不同組（對(duì)照組、NAC 5 mmol/L、BTN 50 μmol/L、NAC 5 mmol/L+BTN 50 μmol/L）處理A549細(xì)胞24 h后，與對(duì)照組相比，NAC 5 mmol/L組處理對(duì)ROS含量和細(xì)胞活力無(wú)影響（P > 0.05）；與BTN 50 μmol/L組相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L組ROS含量顯著降低，細(xì)胞活力顯著提高（P < 0.05）。表明NAC有效抑制ROS生成后，BTN抑制細(xì)胞活力的能力顯著降低。見(jiàn)圖6。

2.6.2 Western blot檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組相比，NAC 5 mmol/L組p-STAT3表達(dá)明顯減少（P < 0.05），STAT3、Bax和Bcl-2表達(dá)無(wú)明顯變化（P > 0.05）。與BTN 50 μmol/L組相比，BTN 50 μmol/L+NAC 5 mmol/L組Bax表達(dá)明顯減少，p-STAT3、Bcl-2表達(dá)顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而STAT3表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。表明抑制ROS生成能夠拮抗BTN抑制STAT3磷酸化和促凋亡作用。見(jiàn)圖7。

2.7 腹腔注射BTN對(duì)裸鼠在體腫瘤及Western blot檢測(cè)瘤體p-STAT3含量影響

同批次裸鼠肩部皮下注射對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞9×106個(gè)/只，待瘤體體積達(dá)到100 mm3時(shí)開(kāi)始每日腹腔注射PBS、2 mg/kg BTN、4 mg/kg BTN，每3天測(cè)量記錄體重和腫瘤體積，發(fā)現(xiàn)BTN處理對(duì)裸鼠體重?zé)o影響（P > 0.05），但劑量依賴(lài)地抑制腫瘤生長(zhǎng)（P < 0.05），28 d時(shí)，三組腫瘤體積分別為（861±63）、（495±53）、（362±49）mm3，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)圖8。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，BTN處理組瘤體p-STAT3表達(dá)明顯下調(diào)，呈濃度依賴(lài)性（P < 0.05），但對(duì)STAT3表達(dá)無(wú)明顯變化（P > 0.05）。見(jiàn)圖9。

3 討論

肺腺癌的治療手段主要是手術(shù)和放化療，但是其遠(yuǎn)期效果并不理想[10-14]，探索新型抗腫瘤藥物如紫鉚因等成為臨床和基礎(chǔ)研究熱點(diǎn)[15]。BTN有顯著抗腫瘤作用[1-5]，其機(jī)制與抑制腫瘤細(xì)胞周期、促進(jìn)凋亡、抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)等有關(guān)[1，3-5，16]。本研究證實(shí)BTN具有顯著的抗肺癌作用，有效抑制A549細(xì)胞的活力和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提高Caspase-3活性和ROS含量，并提示BTN誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡與激活氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

STAT3在多腫瘤中呈現(xiàn)持續(xù)的激活（磷酸化）狀態(tài)[6-7]，STAT3持續(xù)激活可導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖和惡性轉(zhuǎn)化，并且與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[17-20]。本研究首次發(fā)現(xiàn)，BTN作用于A549細(xì)胞可顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)p-STAT3和Bcl-2的表達(dá)。上述結(jié)果說(shuō)明BTN可抑制STAT3激活發(fā)揮抗肺腺癌作用，此結(jié)果同樣在A549細(xì)胞裸鼠種植瘤模型中的到驗(yàn)證。

過(guò)往研究表明，上調(diào)ROS含量抑制STAT3激活進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[2，8-9，17]。本項(xiàng)研究應(yīng)用NAC抑制A549細(xì)胞ROS生成后，可顯著拮抗BTN抑制A549細(xì)胞STAT3磷酸化和促凋亡作用。本研究首次證實(shí)BTN抑制A549細(xì)胞STAT3激活與上調(diào)ROS生成有關(guān)，進(jìn)一步拓展了BTN作為新型抗肺癌天然藥物的作用機(jī)制。然而，BTN上調(diào)ROS含量后如何抑制STAT3磷酸化的具體作用機(jī)制尚未完全明確，以及BTN是否有潛在的毒副作用仍需深入研究。

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