CellSearch系統(tǒng)檢測胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞及臨床意義

賈海明，米泰宇，楊 雯，賈彬彬，張克玲，蒲 競

（蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046）

CellSearch系統(tǒng)檢測胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞及臨床意義

賈海明，米泰宇*，楊 雯，賈彬彬，張克玲，蒲 競

（蘭州市第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730046）

CellSearch系統(tǒng)；胃癌；循環(huán)腫瘤細胞

循環(huán)腫瘤細胞（Circulating Tumor Cells，CTC）是指在腫瘤患者外周血中檢測到來源于實體腫瘤、逃離宿主免疫殺傷后存活的異質(zhì)性腫瘤細胞。19世紀許多學者發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞能通過血流傳播到遠處器官[1]。1869年，Cristofanilli等[2]在惡性腫瘤患者外周血中發(fā)現(xiàn)了與原發(fā)灶腫瘤性質(zhì)相似的細胞，首次提出循環(huán)腫瘤細胞的概念。1889年，Chafer等[3]提出了“種子和土壤”假說，解釋了腫瘤原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶之間的關系。腫瘤的原發(fā)病灶往往并不致死，因腫瘤轉(zhuǎn)移和復發(fā)所引起的死亡約占實體瘤的90%[4]。循環(huán)腫瘤細胞可能代表原發(fā)腫瘤的表型和遺傳組成，被稱為潛在的轉(zhuǎn)移性腫瘤的“液體活檢”。

CellSearch系統(tǒng)是目前自動化程度最高的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術，受人為因素影響較小，該系統(tǒng)集免疫磁珠富集技術和免疫熒光技術于一體，具有較高的特異性、敏感性及可重復性[5]。該系統(tǒng)是目前唯一被美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌或前列腺癌循環(huán)腫瘤細胞檢測的新技術[6～8]。近年來，應用該系統(tǒng)檢測肺癌及其他實體瘤循環(huán)腫瘤細胞的研究也越來越受重視，而且通過該系統(tǒng)分析循環(huán)腫瘤細胞分子標記的研究也漸有嘗試。我們采用CellSearch系統(tǒng)檢測47例胃癌患者的循環(huán)腫瘤細胞，現(xiàn)報告如下。

1 對象與方法

1.1 對象

搜集2014年4月至2016年5月就診于蘭州市第二人民醫(yī)院，并經(jīng)病理證實為胃癌的患者共47例，其中女19例，男28例；年齡≤60歲者29例，＞60歲者18例；I期患者3例，Ⅱ期患者8例，Ⅲ期患者27例，Ⅳ期患者9例。慢性胃炎患者40例，其中女24例，男26例，平均年齡（54.42±8.76）歲。健康志愿者40例，其中女26例，男14例，平均年齡（47.60±10.37）歲。將以上人群作為研究對象。

1.2 儀器與設備

9541循環(huán)上皮細胞自動樣本處理系統(tǒng)（上海寶騰生物醫(yī)藥科技有限公司）；9555循環(huán)上皮細胞結(jié)果分析系統(tǒng)（上海寶騰生物醫(yī)藥科技有限公司），包括CellSave儲存管、CellSearch試劑盒、CellTracks自動處理系統(tǒng)、磁槽、CellTracks自動分析儀。

1.3 納入標準和排除標準

納入標準：（1）經(jīng)病理學檢查確診的患者；（2）入組前未接受任何形式的抗腫瘤治療；（3）既往無其他惡性腫瘤病史；（4）自愿參與此次研究。排除標準：（1）合并終末期肝病或者腎病的患者；（2）合并全身其他惡性腫瘤的患者。

2 方法

2.1 樣本處理

空腹抽取肘靜脈血7.5m l，標記錐形管，將每支CellSave儲存管中的7.5m l血液注入帶有標記的CellTracks AutoPrep錐形管內(nèi)進行混合，加入6.5ml稀釋緩沖液，蓋好裝有血液的Cell-Tracks AutoPrep錐形管，并顛倒混勻5次，以2 000 r/min離心10分鐘，樣本準備完成1小時內(nèi)，在CellTracks AutoPrep系統(tǒng)上對試管進行處理。

2.2 CTC無創(chuàng)性標準化檢測

系統(tǒng)自動處理樣本，磁珠富集EpCAM陽性細胞，細胞固定后依次加入藻紅蛋白（PE）標記的CK81/81/9抗體、藻藍蛋白（APC）標記的CD45抗體，使用4，6-二脒基-2-苯基吲哚（4，6-diamin-odino-2-phenylindole，DAPI）對細胞核進行染色。處理后的樣品自動轉(zhuǎn)入MagNest，避光孵育20分鐘后放入Analyzer系統(tǒng)進行熒光掃描分析并還原成圖像，系統(tǒng)分選符合腫瘤細胞形態(tài)、CK的細胞供人工判讀，CK+DAPI+CD45的細胞被定義為循環(huán)腫瘤細胞。

2.3 統(tǒng)計學方法

對所獲得的實驗數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 胃癌組、慢性胃炎組、健康對照組循環(huán)腫瘤細胞陽性人數(shù)比例比較

胃癌組循環(huán)腫瘤細胞陽性比例在術前、術后、化療前及化療后均明顯高于慢性胃炎組以及健康對照組（P＜0.05），具體見表1。

3.2 循環(huán)腫瘤細胞與性別、年齡的關系

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞與性別、年齡之間無顯著相關性（P＞0.05）。

3.3 循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤標記物的相關性

表1 胃癌組、慢性胃炎組、健康對照組循環(huán)腫瘤細胞陽性人數(shù)比例比較[n（%）]

研究顯示，胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤標記物CEA、CA125、CA153、CA199、CA724之間無顯著相關性（P＞0.05）。

3.4 循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤分期的關系

I～Ⅱ期胃癌患者11例，其中4例循環(huán)腫瘤細胞陽性（36.4%）；Ⅲ～Ⅳ期胃癌患者36例，其中24例循環(huán)腫瘤細胞陽性（66.7%），兩組間循環(huán)腫瘤細胞陽性率比較，差異有顯著性（P＜0.05）。T1～T2和T3～T 4期胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率分別為46.4%和57.9%，兩組間循環(huán)腫瘤細胞陽性率比較，差異無顯著性（P＞0.05）。淋巴結(jié)分期為N0～N1、N2～N3胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率分別為46.2%、76.2%，兩組間循環(huán)腫瘤細胞陽性率比較，差異有顯著性（P＜0.05）。無遠處轉(zhuǎn)移（M0）的胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率為55.3%，有遠處轉(zhuǎn)移（M1）的胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率為77.8%，兩組循環(huán)腫瘤細胞陽性率比較，差異有顯著性（P＜0.05），具體見表2。

表2 循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤分期的關系

4 討論

4.1 胃癌患者循環(huán)腫瘤細胞陽性率分析

血液轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要途徑之一，是否存在遠處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤臨床分期的判斷標準之一。雖然血液中檢測到腫瘤細胞并不意味著一定存在轉(zhuǎn)移灶，但是研究表明，循環(huán)腫瘤細胞的存在與腫瘤分期具有明顯的相關性（P＜0.05）[9]，而目前的臨床分期基于影像學或病理學檢查結(jié)果，難以精確反映轉(zhuǎn)移灶對患者治療和預后的影響。劉志東等[10]研究發(fā)現(xiàn)，外周血循環(huán)存在腫瘤細胞可被視為腫瘤TNM分期的TX狀態(tài)，作為精確臨床分期的必要補充，有利于對患者的預后做出更準確的預測。Sastre等[11]使用CellSearch系統(tǒng)檢測大腸癌患者的循環(huán)腫瘤細胞，結(jié)果顯示，循環(huán)腫瘤細胞陽性率與原發(fā)腫瘤部位、癌胚抗原、乳酸脫氫酶升高水平及腫瘤分化程度無關（P＞0.05），但與結(jié)腸癌的臨床分期有關（P＜0.05），且循環(huán)腫瘤細胞在結(jié)腸癌的早期即可檢測到，表明循環(huán)腫瘤細胞檢測有助于早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌及可能出現(xiàn)的微轉(zhuǎn)移。Tanaka等[12]通過CellSearch系統(tǒng)檢測125例原發(fā)性肺癌患者及25例非惡性腫瘤患者的循環(huán)腫瘤細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在38例肺癌患者外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞，3例非惡性腫瘤患者外周血中檢測到循環(huán)腫瘤細胞，且肺癌患者循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)顯著高于非惡性腫瘤患者（P＜0.05），對于肺癌患者，小細胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)顯著高于非小細胞肺癌患者（P＜0.05），且循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)隨著疾病嚴重程度（分期）的增加而顯著增加（P＜0.05），Ⅳ期患者循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)顯著高于Ⅰ期患者（P＜0.05），有遠處轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)顯著高于無轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05），這表明循環(huán)腫瘤細胞計數(shù)是診斷遠處轉(zhuǎn)移的一個標志，但Tanaka等[12]提示，循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床應用價值有待進一步驗證。但是，Hofman等[13]應用 CellSearch系統(tǒng)檢測非小細胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，循環(huán)腫瘤細胞的存在與腫瘤分期及其組織學類型無關（P＞0.05）?？梢?，對于循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤臨床分期的相關性眾說紛紜，為明確其確切意義，尚需進一步開展大規(guī)模、高質(zhì)量的臨床研究來驗證。

4.2 循環(huán)腫瘤細胞檢測的應用前景

循環(huán)腫瘤細胞標準化檢測已經(jīng)成為美國乳腺癌、前列腺癌和結(jié)腸癌等腫瘤轉(zhuǎn)移性診斷、療效檢測和預后判斷的重要依據(jù)。但是，對我國高發(fā)腫瘤——胃癌的研究卻很少。因此，本研究采用目前國際上先進的循環(huán)腫瘤細胞無創(chuàng)性標準化檢測技術，針對我國常見的胃癌早期診斷標志物進行系列研究，獲取國人常見腫瘤發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移過程中循環(huán)腫瘤細胞的基本數(shù)據(jù)，并與血清標志物數(shù)據(jù)進行比對。結(jié)果表明，胃癌患者血循環(huán)腫瘤細胞陽性率顯著高于慢性胃炎患者和健康人群（P＜0.05），而與胃癌患者的年齡、性別無明顯關系（P＞0.05），這提示循環(huán)腫瘤細胞也許可以成為診斷胃癌的血液學指標，以提高胃癌的早期診斷率；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其他遠處轉(zhuǎn)移患者的循環(huán)腫瘤細胞陽性率高于無轉(zhuǎn)移的胃癌患者（P＜0.05），這提示血液中循環(huán)腫瘤細胞的出現(xiàn)與胃癌轉(zhuǎn)移密切相關。另外，部分早期胃癌患者外周血中可查到循環(huán)腫瘤細胞，這表明早期胃癌在未出現(xiàn)明顯影像學轉(zhuǎn)移灶時已發(fā)生微轉(zhuǎn)移，這將對胃癌的診斷及制訂治療方案方面起到至關重要的作用。腫瘤臨床分期越高，循環(huán)腫瘤細胞的陽性率越高。

4.3 循環(huán)腫瘤細胞檢測的臨床應用價值

大量研究證實，循環(huán)腫瘤細胞與腫瘤復發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關（P＜0.05），檢測循環(huán)腫瘤細胞有助于腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、臨床分期、療效監(jiān)測及預后判斷，并為腫瘤患者個體化治療提供臨床指導。作為一種標準化的檢測體系，CellSearch系統(tǒng)的出現(xiàn)，使得在臨床常規(guī)開展循環(huán)腫瘤細胞檢測成為可能。此外，CellSearch系統(tǒng)以及其他的循環(huán)腫瘤細胞檢測技術也在不斷改進和發(fā)展，這有助于我們更深入地了解腫瘤轉(zhuǎn)移的生物學特性，動態(tài)實時地分析患者的腫瘤分子特征，為真正的個體化治療提供依據(jù)。

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（*通訊作者：米泰宇）

R735.2

：A

1671-1246（2017）17-0149-03

注：本文系甘肅省自然科學基金（145RJZA057）