血漿MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平與肺動(dòng)脈高壓預(yù)后的相關(guān)性研究

張 巖， 王聰霞

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710004)

血漿MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平與肺動(dòng)脈高壓預(yù)后的相關(guān)性研究

張 巖， 王聰霞*

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科， 陜西 西安 710004)

目的：探討患者血漿MicroRNA-17-5p和microRNA-20水平與與肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)嚴(yán)重程度、預(yù)后的相關(guān)性。方法：采用微陣列法篩選112例PAH患者和100例健康對(duì)照者的血漿總RNA，采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定miRNA-17-5p和miRNA-20a含量，測(cè)量PAH患者血漿中miRNA-17-5p、miRNA-20a的濃度。結(jié)果：在血漿miRNA濃度測(cè)定中，總共有58例miRNA血漿濃度在病例組和對(duì)照組中差異具有顯著性。在PAH組中，miRNA-17-5p和miRNA-20a上調(diào)最為明顯。ROC曲線分析顯示血漿miRNA-17-5p、miRNA-20a的濃度與PAH患者兩年生存率相關(guān)。Cox回歸分析證實(shí)miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH生存率的重要預(yù)測(cè)因素。年齡、心臟指數(shù)、WHO分級(jí)、6min步行距離、疾病持續(xù)時(shí)間、紅細(xì)胞分布寬度也可作為生存率的預(yù)測(cè)因子，加入這些協(xié)變量的多變量模型驗(yàn)證miRNA-17-5p和miRNA-20a水平是PAH兩年生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。結(jié)論：血漿中miRNA-17-5p和miRNA-20a水平的增加與PAH患者的不良預(yù)后有關(guān)。

miRNA-17-5p； miRNA-20a； 肺動(dòng)脈高壓

我國(guó)的PAH的發(fā)病率和死亡率近年來(lái)迅速增加，已成為威脅我國(guó)公民健康的主要疾病。肺動(dòng)脈高壓是一種肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(PAECs)和肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)過(guò)度增殖導(dǎo)致的可致命的疾病。增生導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)的變化，表現(xiàn)為PAECs和PASMCs的功能障礙，這是PAH的發(fā)病機(jī)制。增生進(jìn)一步造成肺血管阻力增加，導(dǎo)致右心室心力衰竭[1]。miRNA是非蛋白編碼RNA分子，參與多種必需基因的表達(dá)和細(xì)胞進(jìn)化的過(guò)程，可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后表達(dá)。向下調(diào)節(jié)基因表達(dá)的miRNA結(jié)合3’末端非翻譯區(qū)域的miRNA，有效的結(jié)合Watson-Crick配對(duì)算法，可以預(yù)測(cè)miRNA的靶基因[2]。miRNA可能在肺血管疾病通路中參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，在肺血管生長(zhǎng)發(fā)育、疾病形成中起重要作用，肺血管穩(wěn)態(tài)的破壞和此類(lèi)miRNA下調(diào)參與PAH的發(fā)病機(jī)制[3]。骨形態(tài)蛋白Ⅱ型受體(BMPR2)、缺氧、STAT3和Apelin-APJ肺血管細(xì)胞信號(hào)通路與PAH的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。目前的研究表明，miRNA-17-5p和miRNA-20a與擴(kuò)張型心肌病、先天性心臟病和中風(fēng)相關(guān)。本研究的目的是探究血漿miRNA-17-5p和miRNA-20a與PAH嚴(yán)重程度、預(yù)后的相關(guān)性，進(jìn)一步闡明miRNA是否可作為PAH病情程度及預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子及潛在生物學(xué)指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2010年1月至2013年12月患者進(jìn)行PAH病例對(duì)照研究。病例組納入112例PAH的患者，均符合PAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)。PAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)最新指南制定出的[5]。同時(shí)選取100例健康者作為對(duì)照組。兩組在性別、年齡上差異無(wú)顯著性。與研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)，經(jīng)過(guò)嚴(yán)格培訓(xùn)的調(diào)查員調(diào)查研究對(duì)象，采用統(tǒng)一的調(diào)查問(wèn)卷，并隨機(jī)進(jìn)行質(zhì)量控制。

1.2 方法:每個(gè)研究對(duì)象均空腹采集5mL外周血，1mL被送到實(shí)驗(yàn)室立即測(cè)定血液生化指標(biāo)檢測(cè)，包括血糖、總膽固醇、甘油三酯，用全自動(dòng)生化分析儀(德國(guó)的歐羅巴XL-200)。其余4mL肝素抗凝并存儲(chǔ)在-80℃的冰箱。在這項(xiàng)研究中，通過(guò)電話隨訪患者，總共106個(gè)PAH患者隨訪24個(gè)月?；颊叩纳鏍顟B(tài)在2015年12月20日被調(diào)查，死亡是主要終點(diǎn)。6名患者失訪，主要是因?yàn)殄e(cuò)誤的電話號(hào)碼、拒絕繼續(xù)參與、搬出原來(lái)的地址或地址不清。失訪患者基本人口學(xué)資料(年齡、性別、吸煙、飲酒)與研究組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)了本項(xiàng)研究，并按照《赫爾辛基宣言》進(jìn)行了研究。所有受試者均獲得書(shū)面知情同意書(shū)。

1.3 microRNA檢測(cè):采用Tiangen試劑盒提取。先提取全血基因組DNA，從血漿、循環(huán)血細(xì)胞和肺組織中分離出總RNA。利用高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)，7900HT(96孔、384孔和Taqman低密度表達(dá)譜芯片兼容)，進(jìn)行PCR反應(yīng)和端板進(jìn)行閱讀和分析。miRNA的檢測(cè)采用“geniom MEPA”芯片(FEBIT生物醫(yī)學(xué)有限公司，海德堡，德國(guó))。到目前為止，非管家基因的miRNA已被規(guī)范化驗(yàn)證。在樣本中添加5nmoL/L秀麗隱桿線蟲(chóng)mir-39(cel-mir-39)，cel-mir-39是一個(gè)公認(rèn)的對(duì)RNA制劑進(jìn)行規(guī)范化測(cè)量的標(biāo)志物。為最大限度檢測(cè)miRNA的信息，采用微陣列檢測(cè)受試者血漿樣本的總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)分別測(cè)量miRNA的含量。采用四分位數(shù)法、背景減法和消除極端離群值，進(jìn)行數(shù)量統(tǒng)計(jì)。熒光定量PCR的方法檢測(cè)與應(yīng)用生物系統(tǒng)進(jìn)行(卡爾斯巴德、CA)，microRNA檢測(cè)應(yīng)用Applied Biosystems儀檢測(cè)(圖1)。

圖1 miRNA-17-5p和miRNA-20a測(cè)定曲線

1.4 統(tǒng)計(jì)分析:χ2檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間一般資料的分析。通過(guò)篩選分析，miRNA在病例組與對(duì)照組之間的最高倍的差異被認(rèn)為是有研究?jī)r(jià)值的miRNA。采用多元Logistic回歸分析計(jì)算其95% CI，OR值表示相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)。隨訪時(shí)間為主要心血管事件發(fā)生日期、最后隨訪日期與診斷日期的差異。丟失的例數(shù)排除在審查數(shù)據(jù)外。ROC曲線評(píng)估全因死亡率下降和生物標(biāo)志物兩者之間的關(guān)系，以及生物標(biāo)志物與預(yù)后之間的關(guān)系。Kaplan Meier進(jìn)行生存分析，miRNA與患者死亡的發(fā)生率也進(jìn)行相關(guān)分析。多變量Cox回歸分析模型被用來(lái)計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(HR)和95%可信區(qū)間。所有統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均為雙概率檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0軟件包進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較:從表1可以看出，病例組和對(duì)照組的年齡和性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組與對(duì)照組收縮壓、舒張壓、體重指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。病例組吸煙率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。兩組飲酒量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。此外，病例組高血壓史、糖尿病史及冠心病家族史均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。病例組高血壓史明顯高于對(duì)照組，但兩組間收縮壓和舒張壓差異不顯著，可能是由于長(zhǎng)期服用抗高血壓藥物的關(guān)系。miRNA-17-5p和miRNA-20a在血漿分布中差異無(wú)顯著性，血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)、治療方法、N末端腦鈉肽(NT-proBNP)、紅細(xì)胞分布寬度(RDW)同為研究?jī)?nèi)容(表2)。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與6MWD、年齡和病程(表2，3)相關(guān)性較差。

2.2 miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與PAH預(yù)后的相關(guān)性分析：從ROC曲線上看，miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平與PAH患者2年生存率相關(guān)，與6mwd的距離也相關(guān)，是PAH生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(圖2A)。患者miRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距離縮短，且與生存時(shí)間縮短密切相關(guān)(圖2C，D)。ROC分析也評(píng)估了最佳截?cái)嘀担琺icrorna-17-5p含量大于0.000689是預(yù)測(cè)2年生存率的重要指標(biāo)(特異度76.5%，敏感度76.8%)，且在PAH的組中死亡率也較高(圖2A)。miRNA-20a含量大于0.000732可用來(lái)預(yù)測(cè)PAH患者的2年生存率，特異度91.3%，靈敏度58.8%，可作為一個(gè)高危亞組(圖2A)。

圖2 miRNA-17-5p和miRNA-20a 水平與PAH預(yù)后的相關(guān)性分析

Cox回歸生存分析確定miRNA-17-5p和miRNA-20a可PAH患者生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。年齡、EF值、WHO功能分級(jí)、6MWD、病程時(shí)間和RDW也可預(yù)測(cè)生存率(表4)。RDW及6MWD可獨(dú)立預(yù)測(cè)PAH的生存率，增加了microrna-17-5p和miRNA-20a水平的多因素模型中，miRNA-17-5p 和miRNA-20a水平是PAH生存率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(危險(xiǎn)比0.589，P = 0.012；危險(xiǎn)比0.478，P<0.01)。在雙變量模型中，研究的隊(duì)列數(shù)據(jù)顯示miRNA-17-5p和miRNA-20a是校正了年齡、EF值、疾病時(shí)間、NT-proBNP后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子(表4)。

表1 一般資料比較

表2 miR17-5p水平在病例組中的分布情況

表3 miR20a水平在病例組中的分布情況

表4 Cox回歸生存分析

3 討 論

miRNA是一類(lèi)高度保守的非編碼小RNA的單鏈分子，長(zhǎng)度約21至24個(gè)核苷酸。它與靶mRNA互補(bǔ)配對(duì)可以識(shí)別靶mRNA，通過(guò)降解mRNA或抑制其蛋白質(zhì)的翻譯而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因的表達(dá)調(diào)控。因此，miRNA參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化和增殖等生命過(guò)程。miRNA能夠針對(duì)多個(gè)蛋白編碼基因，參與多個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育階段的調(diào)控，在維護(hù)肺血管的平衡穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要的作用。miRNA表達(dá)的異?？赡苁歉鞣N疾病包括PAH的發(fā)病機(jī)制。

研究表明，miRNA-204在PAH患者的肺組織和PASMCs含量降低，并且在動(dòng)物模型上發(fā)現(xiàn)miRNA-204與細(xì)胞增殖相關(guān)。miR-17/92簇也在PAH中表達(dá)，可通過(guò)IL-6信號(hào)通路下調(diào)(BMPR)-2下游區(qū)域[6]。miR-21可以通過(guò)BMP-Smad信號(hào)通路誘導(dǎo)，已報(bào)道其在PAH患者的血液細(xì)胞和肺組織樣本下調(diào)[7]。miRNA與肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)miRNA的變化及調(diào)節(jié)可能參與PAH的病理生理過(guò)程[8]。BMPR2信號(hào)通路在維持肺血管穩(wěn)態(tài)[9]中起著至關(guān)重要的作用，這一信號(hào)通路受到干擾和BMPR2基因突變可能形成PAH[10]。雖然BMPR2功能障礙被認(rèn)為是肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病特征，很少有研究評(píng)估PAH與BMPR2功能障礙的相關(guān)機(jī)制。miRNAs是否參與BMPR2與PAH的發(fā)病過(guò)程尚未有相關(guān)研究。

有研究表明，miRNA-BMPR2信號(hào)通路的研究中，IL-6介導(dǎo)STAT3的激活誘導(dǎo)細(xì)胞miR-17-92基因簇的表達(dá)[11]。通過(guò)相應(yīng)的miRNA基因簇編碼miR-17-5p和miR-20a，可以針對(duì)性的下調(diào)BMPR2蛋白的表達(dá)[12]。因此，曾有兩組研究評(píng)價(jià)這兩個(gè)miRNA(miR-17和miR-20a)抑制劑治療PAH的潛力。在嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型上，靜脈注射miR-17抑制劑已被證明是改善實(shí)驗(yàn)性肺動(dòng)脈高壓(PAH)的手段。此外，用miR-17抑制劑[13]治療后，細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A(P21)，一個(gè)已知的miR-17目標(biāo)基因，在小鼠和大鼠的肺組織中含量增加，在人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中也呈增加趨勢(shì)[14]。同時(shí)也有研究表明，miR-20a抑制劑治療對(duì)缺氧誘導(dǎo)的PAH模型小鼠右心室肥厚和肺動(dòng)脈血管重構(gòu)有改善作用，通過(guò)肺組織及肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞BMPR2的下游信號(hào)通路的誘導(dǎo)BMPR2的表達(dá)[15]。

本研究通過(guò)測(cè)定PAH的血漿miRNA的差異，提示miRNA-17-5p和miRNA-20a水平與PAH嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。miRNA-17-5p和miRNA-20a水平升高，6min步行距離縮短，且與生存時(shí)間縮短密切相關(guān)。miRNA-17-5p含量大于0.000689是預(yù)測(cè)2年生存率的重要指標(biāo)，且在PAH的組中死亡率也較高。miRNA-20a含量大于0.000732可用來(lái)預(yù)測(cè)PAH患者的2年生存率，可作為一個(gè)高危亞組。兩者皆是6MWD、WHO功能分級(jí)和其他臨床指標(biāo)以外的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

本研究得出以下結(jié)論，miRNA-17-5p、miRNA-20a血漿水平PAH的生存率相關(guān)。miRNA-17-5p、miRNA-20a的重要性仍需進(jìn)一步研究，其他miRNA與肺動(dòng)脈高壓的關(guān)系也需做進(jìn)一步的相關(guān)研究。miRNA和PAH形成調(diào)節(jié)關(guān)系的研究為研究者揭示全新的視野，本研究為miRNA對(duì)肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞離子通道影響提供依據(jù)，為PAH患者預(yù)后的預(yù)測(cè)提供獨(dú)立的生物學(xué)指標(biāo)。

[1] Chandra SM, Razavi H, Kim J,et al . Disruption of the Apelin-APJ system worsens hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].Arterioscl Throm Vas, 2011, 31(5): 814～821.

[2] Kim J. Apelin-APJ Signaling: a potential therapeutic target for pulmonary arterial hypertension[J].Mol Cells, 2014,37(5): 196～201.

[3] Courboulin A, Paulin R, Giguere NJ, et al. Role for miR-204 in human pulmonary arterial hypertension[J].Exp Med, 2011,211(9):535～548.

[4] Brock M, Trenkmann M, Gay RE, et al. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type Ⅱ through a novel STAT3-microRNA cluster 17/92 pathway[J].Circ Res, 2009,104(10):1184～1191.

[5] Mclaughlin VV, Archer SL, Badesch DB, et al. ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension: a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association[J].Circulation, 2009,119(6):2250～2294.

[6] Davis BN, Hilyard AC, Lagna G, et al. SMAD proteins control DROSHA-mediated microRNA maturation[J].Nature, 2008,454(6):56～61.

[7] Caruso P, Maclean MR, Khanin R, et al. Dynamic changes in lung microRNA process during the development of pulmonary hypertension due to chronic hypoxia and monocrotaline[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol ,2010,30(7):716～723.

[8] Parikh VN, Jin RC, Rabello S, et al. MicroRNA-21 integrates pathogenic signaling to control pulmonary hypertension: results of a network bioinformatics approach[J].Circulation, 2012, 125(8):1520～1532.

[9] Hogan BL. Bone morphogenetic proteins: multi-functional regulators of vertebrate development[J].Genes Dev, 2015,10(7): 1580～1594.

[10] Machado RD, Aldred M A, James V, et al . Mutations of the TGF-beta type Ⅱ receptor BMPR2 in pulmonary arterial hypertension[J].Hum Mutat, 2016, 27(8):121～132.

[11] Brock M, Trenkmann M, Gay R E,et al. Interleukin-6 modulates the expression of the bone morphogenic protein receptor type Ⅱ through a novel STAT3-microRNA cluster 17/92 pathway[J].Circ Res, 2015, 104(8):1184～1191.

[12] Pullamsetti SS, Doebele C, Fischer A, et al. Inhibition of microRNA-17 improves lung and heart function in experimental pulmonary hypertension[J].Am Respir Crit Care Med, 2013,185(7): 409～419.

[13] Brock M, Samillan VJ, Trenkmann M, et al. Antagomir directed against miR-20a restores functional BMPR2 signalling and prevents vascular remodelling in hypoxia-induced pulmonary hypertension[J].Eur Heart, 2012, 12(4):60～70.

[14] Zaidi SH, You XM, Ciura S, et al. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension[J].Circulation ,2002,105(9):516～521.

[15] Takahashi H, Goto N, Kojima Y, et al. Down regulation of type Ⅱ bone morphogenetic protein receptor in hypoxic pulmonary hypertension[J].Am Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2006,290(8):450～458.

Correlation between Plasma Levels of MicroRNA-17-5p andmicroRNA-20 and Prognosis of Pulmonary Arterial Hypertension

ZHANGYan,WANGCongxia,LIYongqin,etal

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,ShaanxiXi'an710004,China)

Objective:To investigate the correlation between the level of plasma MicroRNA-17-5p and microRNA-20 and the severity and prognosis of pulmonary arterial hypertension (PAH). Methods: A microarray screen was performed on total plasma RNA from 112 patients with PAH and 100 healthy control subjects Quantitative polymerase chain reaction commend increased microRNA-17-5p and microRNA-20a concentrations and was then used to measure microRNA-17-5p and microRNA-20a levels in cohort of patients with PAH's circulating microvesicles and blood cells. Results: Fifty-eight miRNAs showed differences in plasma concentration. MicroRNA-17-5p and microRNA-20a are the largest up-regulation in PAH. Receiver-operator-characteristic analysis showed both raw and normalized plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels correlated with 2-year survival in patients with PAH. Cox regression analysis confirmed that miRNA-17-5p and miRNA-20a levels were important predictors of PAH survival. Age, baseline cardiac index, World Health Organization functional class, 6-minute walk distance, disease duration, and red cell distribution width also predicted survival. Entering these covariates in a multivariable model veried plasma microRNA-17-5p and microRNA-20a levels as independent predictoras of survival in PAH. Conclusion: Increased circulating microRNA-17-5p and microRNA-20a levels are associated with poor survival in PAH.

miRNA-17-5p; miRNA-20a; Pulmonary arterial hypertension

1006-6233(2017)08-1236-06

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.08.002

*【通訊作者】王聰霞， 李永勤， 張春艷， 胡艷超， 李滿(mǎn)祥