Gab2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞外黏附作用的影響

劉玉輝, 孫慶慶, 郭 放

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科, 遼寧 沈陽, 110006)

Gab2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞細(xì)胞外黏附作用的影響

劉玉輝, 孫慶慶, 郭 放

(沈陽軍區(qū)總醫(yī)院 腫瘤科, 遼寧 沈陽, 110006)

; 目的 探討Gab2對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞外黏附作用的影響。方法 選取SW620和HCT116兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系，建立Gab2 表達(dá)降低和Gab2 表達(dá)升高的穩(wěn)定細(xì)胞株。將實(shí)驗(yàn)NOD/SCID小鼠分為3組，每組10只。① 對(duì)照組; 接種scr/MGC803體結(jié)腸癌細(xì)胞; ② Gab2降低組; 接種Gab2降低的siGab2/MGC803結(jié)腸癌細(xì)胞; ③ Gab2升高組; 接種Gab2升高的Gab2/MGC803結(jié)腸癌細(xì)胞。檢測細(xì)胞遷移能力，測量腫瘤的大小和侵襲范圍及細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果 處理后3組細(xì)胞遷移數(shù)計(jì)算結(jié)果顯示, Gab2降低組的細(xì)胞遷移數(shù)顯著低于Gab2升高組和對(duì)照組(P<0.05)。各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，比較接種前與接種后小鼠體質(zhì)量, Gab2降低組顯著低于Gab2升高組、對(duì)照組，對(duì)照組低于Gab2升高組。測量瘤體積，Gab2升高組高于Gab2降低組、對(duì)照組。Gab2降低組瘤體積抑制率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與Gab2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。結(jié)論 Gab2可有效調(diào)控體外細(xì)胞遷移數(shù)，顯著抑制小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移，通過調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌生長及轉(zhuǎn)移。

結(jié)腸癌; Gab2; 細(xì)胞外黏附作用

結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其較高的侵襲能力和多耐藥性是目前的研究難點(diǎn)。作者擬通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)、免疫缺陷鼠注射實(shí)驗(yàn)，圍繞結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移、結(jié)腸癌細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、結(jié)腸癌對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解這幾個(gè)影響結(jié)腸癌侵襲的機(jī)制，闡明Gab2在結(jié)腸癌侵襲過程中的重要作用及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，揭示Gab2與已知的結(jié)腸癌侵襲相關(guān)的信號(hào)分子的關(guān)系及相互作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

6～8周齡大的NOD/SCID小鼠，體質(zhì)量22 g左右，由中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房提供。人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620和HCT116引自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所, BCA試劑盒來源于北京天根生化科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與計(jì)數(shù): 利用慢病毒載體小RNA干擾技術(shù)，建立Gab2 表達(dá)降低的穩(wěn)定細(xì)胞株(Gab2降低組)，將野生型Gab2 cDNA序列轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞，建立Gab2 表達(dá)升高的穩(wěn)定細(xì)胞株(Gab2升高組)。將經(jīng)過處理細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞重懸于BM(RPMI 1640, 0.1 BSA, 25 mmol/L HEPES)中，使之最終濃度為0.5×106cell/mL。在趨化小室下層板中加入因子，每孔30 μL。上、下層板間加入一張濾膜(0.001%纖維連接蛋白，厚度8 μm, 4 ℃下包被過夜)，上層板中每孔加入細(xì)胞懸液50 μL, 放入孵箱內(nèi)，設(shè)置溫度37 ℃, 5%CO2孵育3 h后取出，刮去濾膜上層細(xì)胞，洗滌后染色，在顯微鏡(400倍)下進(jìn)行觀察。每孔取3個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.2 SW620和HCT116細(xì)胞的體外遷移實(shí)驗(yàn): 消化、收集細(xì)胞, PBS洗1～2次，用含BSA的無血清培養(yǎng)基重懸[細(xì)胞密度(1～10)×105/mL]。取適量細(xì)胞懸液加入Transwell小室(按transwell說明), 200 μL 24孔板，下室加入含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基500 μL, 加入過程中避免產(chǎn)生氣泡。將孔板常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.1%結(jié)晶紫染色。顯微鏡進(jìn)行觀察和拍照，取3～5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

1.2.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞接種: 將NOD/SCID小鼠分為3組，每組10只，培養(yǎng)的細(xì)胞消化后按1×107個(gè)將對(duì)照MGC803細(xì)胞、Gab2表達(dá)降低或升高的MGC803細(xì)胞和Gab2表達(dá)升高的MGC803細(xì)胞接種在4周齡NOD/SCID小鼠的前胸壁皮下，分別命名為對(duì)照組、Gab2降低組和Gab2升高組。① 對(duì)照組; 接種scr/MGC803體結(jié)腸癌細(xì)胞; ② Gab2降低組; 接種Gab2降低的siGab2/MGC803結(jié)腸癌細(xì)胞; ③ Gab2升高組; 接種Gab2升高的Gab2/MGC803結(jié)腸癌細(xì)胞。觀察實(shí)驗(yàn)NOD/SCID小鼠的一般狀態(tài)和生存時(shí)間，監(jiān)測荷瘤NOD/SCID小鼠皮下內(nèi)腫瘤生長和侵襲和轉(zhuǎn)移情況，并測量腫瘤的大小和侵襲范圍。各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，取鼠胸壁腫瘤組織和肺臟、肝臟、腎臟、腦組織、腎上腺，計(jì)數(shù)注射部位周邊的衛(wèi)星結(jié)節(jié)數(shù)量和肺臟、肝臟、腎臟、腦組織、腎上腺內(nèi)的轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量，檢測Gab2在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中對(duì)結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。

1.2.4 Gab2與MMP的合成途徑: 細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn); 應(yīng)用明膠酶譜和Western Blotting分別檢測結(jié)腸癌細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶的量和活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn): NOD/SCID小鼠移植瘤切片進(jìn)行Gab2及MMP-2和MMP-9的免疫組化檢測，判斷Gab2的表達(dá)與基質(zhì)金屬蛋白酶合成的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組發(fā)生遷移細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

處理后3組細(xì)胞(400倍顯微鏡視野下)遷移數(shù)計(jì)算結(jié)果, Gab2降低組的細(xì)胞遷移數(shù)(45.09±8.93)個(gè)，顯著低于Gab2升高組(278.93±11.08)個(gè)和對(duì)照組(104.28±7.82)個(gè), 3組比較有顯著差異(P<0.05)。

2.2 監(jiān)測荷瘤NOD/SCID小鼠皮下內(nèi)腫瘤生長和侵襲和轉(zhuǎn)移情況

各組NOD/SCID小鼠均在接種40 d后處死，比較接種前與接種后小鼠體質(zhì)量, Gab2降低組顯著低于Gab2升高組、對(duì)照組，對(duì)照組低于Gab2升高組。測量瘤體積, Gab2升高組高于Gab2降低組、對(duì)照組。Gab2降低組瘤體積抑制率顯著高于對(duì)照組(P<0.05), 見表1。

表1 治療后2組療效評(píng)價(jià)

與Gab2降低組相比, *P<0.05; 與對(duì)照組相比, #P<0.05。

2.3 轉(zhuǎn)染后Gab2與MMP-2、MMP-9表達(dá)的關(guān)系

轉(zhuǎn)染后, Gab2表達(dá)率較高的組織中MMP-2、MMP-9蛋白陽性率高, Gab2蛋白表達(dá)較低的組織中, MMP-2、MMP-9蛋白陽性率低，根據(jù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與Gab2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后Gab2與MMP-2、MMP-9表達(dá)的關(guān)系

3 討 論

近年來，結(jié)腸癌的發(fā)病率和致死率逐年遞增，中國結(jié)直腸惡性腫瘤發(fā)病率位居第4位[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，在眾多的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中, Gab2均發(fā)揮著重要的傳導(dǎo)作用，與部分癌癥、糖尿病及心腦血管疾病有關(guān)，其中以影響惡性腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路為主，在乳腺癌、胃癌、食管癌等惡性腫瘤組組織中高度表達(dá)。研究[3]顯示, Gab2的表達(dá)水平與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移通路相關(guān)，直接影響患者預(yù)后及生存期。

結(jié)腸癌細(xì)胞具備趨化運(yùn)動(dòng)，是結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵，也是結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲的主要因素[4]。本研究證實(shí), Gab2參與了結(jié)腸癌的趨化運(yùn)動(dòng)相關(guān)的信號(hào)通路, Gab2降低組腫瘤細(xì)胞趨化數(shù)量顯著降低。研究[5]表明, Gab2可能通過影響actin的聚合與解聚合的循環(huán)參與了結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移。結(jié)腸癌細(xì)胞與周圍細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力的增加是造成結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn), Gab2降低組的小鼠體質(zhì)量與瘤體積顯著低于Gab2升高組及對(duì)照組, Gab2升高對(duì)于癌細(xì)胞抑制率顯著升高。進(jìn)一步證實(shí)Gab2參與了細(xì)胞外基質(zhì)、結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附過程，使結(jié)腸癌細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移、侵襲。

結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移包括黏附、降解以及移動(dòng)。細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)是阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要屏障, ECM降解酶則會(huì)導(dǎo)致ECM的降解，使ECM失去屏障作用。其中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是ECM降解酶中的重要成分，能降解膠原、明膠、纖維黏連蛋白以及層粘連蛋白等，在腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移的過程中扮演著重要角色。而在多數(shù)惡性腫瘤中發(fā)現(xiàn)MMP-2有著過度表達(dá)[6]。金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)可有效抑制MMP-2的活性，是MMP-2的特異性抑制劑，可發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤的作用[2]。因此MMP-2與TIMP-2的平衡關(guān)系與腫瘤血管化過程有重要關(guān)系[7]。由于ECM是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的屏障，因此觀察ECM水平可有效預(yù)測腫瘤細(xì)胞的侵襲性及轉(zhuǎn)移能力[8]。本研究證實(shí)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染后, Gab2表達(dá)率較高的組織中MMP-2、MMP-9蛋白陽性率高, Gab2蛋白表達(dá)較低的組織中, MMP-2、MMP-9蛋白陽性率低，根據(jù)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與Gab2蛋白表達(dá)成正相關(guān)。

[1] 陳友權(quán), 于燕妮. 胃癌中SDF-1、CXCR4、MMP-2和MMP-9的表達(dá)及意義[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2012, 28(2): 135-139, 143.

[2] 劉巍, 徐為人, 湯立達(dá). Gab2支架蛋白—新的抗癌藥物靶點(diǎn)[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究, 2014, 37(1): 74-81.

[3] Son S Y, Lee C M, Jung D H, et al. Laparoscopic completion total gastrectomy for remnant gastric cancer: a single-institution experience[J]. Gastric Cancer, 2015, 18(1): 177-182.

[4] 蔡偉, 葉青, 唐亮, 等. 蟲草素對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞體外增殖、遷移能力的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用[J]. 中華臨床醫(yī)師雜志: 電子版, 2011, 5(14): 4048-4054.

[5] 丁陳波, 馮繼紅, 羅軍敏. 支架蛋白 Gab2與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2015(5): 699-703.

[6] 奚美麗, 李俊, 鹿欣. Ezrin蛋白在宮頸癌中表達(dá)的臨床意義及其與PCNA、MMP-2、MMP-9、HPV E6蛋白的關(guān)系[J]. 中國癌癥雜志, 2013(11): 904-909.

[7] Tsutsumi S, Oki E, Ida S, et al. Laparoscopic gastrectomy for gastric cancer with peritoneal dissemination after induction chemotherapy[J]. Case Rep Gastroenterol, 2013, 7(3): 516-521.

[8] Mencarelli A, Graziosi L, Renga B, et al. CCR5 Antagonism by Maraviroc Reduces the Potential for Gastric Cancer Cell Dissemination[J]. Transl Oncol, 2013, 6(6): 784-793.

Effect of Gab2 on extracellular adhesion of colon cancer cells

LIU Yuhui, SUN Qingqing, GUO Fang

(Department of Oncology, General Hospital of Shenyang Military Command, Shenyang, Liaoning, 110006)

Objective To investigate the effect of Gab2 on extracellular adhesion of colon cancer cells. Methods SW620 and HCT116 were selected to establish the stable cell lines of Gab2 high expression and Gab2 low expression in two colon carcinoma cell lines. The experiment NOD/SCID mice were divided into 3 groups, 10 rats in each group. The control group included scr/MGC803 inoculation of colon cancer cells, Gab2 reduction group included Gab2 colon cancer cells with reduced inoculation of siGab2/MGC803, and elevated Gab2 group included Gab2/MGC803 colon cancer cells with elevated Gab2 inoculation. Cell migration, tumor size, invasion and cell apoptosis were observed. Results After the treatment, cells transference number calculation results showed that cell migration in GAB2 reduced group was significantly lower than that in GAB2 increased group and control group (P<0.05). NOD/SCID mice were sacrificed 40 days after inoculation, in the comparison of weight of mice before and after inoculation, the Gab2 decreased group was significantly lower than the Gab2 increased group and the control group, and the control group was significantly lower than the Gab2 increased group. In comparison of tumor volume, Gab2 increased group were significantly higher than the Gab2 decreased group and the control group. In Gab2 decreased group, tumor volume inhibition rate was significantly higher than the control group (P<0.05). The correlation analysis showed that MMP-2 and MMP-9 protein expression were positively correlated with GAB2 protein expression. Conclusion Gab2 can effectively regulate the number of cell migration in vitro, significantly inhibit the invasion and metastasis of colon cancer cells in mice, and inhibit the growth and metastasis of colon cancer by regulating the expression of MMP-2 and MMP-9 protein.

colon cancer; Gab2; extracellular adhesion

2017-01-16

遼寧省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目(2015020408)

R 735.3

A

1672-2353(2017)15-061-03

10.7619/jcmp.201715016