腎細胞癌中Wif-1基因的甲基化狀態及表達

倪曉辰, 張愛莉, 衛書飛

(河北醫科大學第四醫院 泌尿外科, 河北 石家莊, 050011)

腎細胞癌中Wif-1基因的甲基化狀態及表達

倪曉辰, 張愛莉, 衛書飛

(河北醫科大學第四醫院 泌尿外科, 河北 石家莊, 050011)

目的 檢測腎細胞癌(RCC)中Wnt抑制因子-1(Wif-1)基因的甲基化狀態及表達水平，探討其在腎細胞癌發生發展中的可能機制。方法 分別應用甲基化特異性PCR(MSP)和逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測56例腎細胞癌及相應癌旁正常腎組織中Wif-1基因的甲基化狀態及表達水平。結果 Wif-1基因在RCC組織中的甲基化率顯著高于相應癌旁正常腎組織(P<0.05)。Wif-1基因在RCC組織中的相對表達量顯著低于相應癌旁正常腎組織(P<0.05)。在RCC組織中, Wif-1基因甲基化陽性組mRNA的相對表達量與甲基化陰性組mRNA的相對表達量比較無顯著差異(P>0.05)。結論 Wif-1基因啟動子區的高甲基化在腎細胞癌的發生中是一個頻發事件。

腎細胞癌; Wif-1; 甲基化; 表達

腎癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，發病率僅次于膀胱癌。隨著環境的惡化以及不良生活習慣等因素的改變，其發病率逐年上升，且呈現年輕化趨勢。由于其早期臨床癥狀不明顯，增加了早期診斷和治療的困難。近年來關于腫瘤在表觀遺傳學方面的研究已成為一個熱點。Wnt信號轉導通路是一條及其復雜的信號轉導通路，在細胞增殖、分化、凋亡等方面有著極其重要的作用, Wif-1是Wnt信號轉導通路的一個抑癌基因，通過阻斷Wnt信號的傳導對腫瘤起到抑制作用。它的異常甲基化可能引起轉錄的異常，從而導致腫瘤的形成。本實驗本實驗通過應用MSP和RT-PCR技術分別檢測56例RCC組織及相應癌旁正常腎組織中Wif-1基因啟動子區甲基化狀態和mRNA的表達情況，并分析其與腎癌發生發展的關系，希望為RCC的早期發現、早期診斷以及預后判斷提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本收集: 研究對象來自2012—2013年河北醫科大學第四醫院泌尿外科住院手術治療的患者共56例，其中男35例，女21例，年齡21～78歲，平均年齡為59.6歲。患者術前均未接受任何放療或化療，手術方式均為腎根治性切除術，標本取腎細胞癌原發灶及相應癌旁正常組織。標本采集后立即于液氮保存。腫瘤直徑最大者約12 cm, 最小約2 cm, 平均約7 cm, 其中小于7 cm的為47例(84%), 大于等于7 cm為9例(16%)。按美國癌癥聯合委員會(AJCC)標準進行臨床分期: Ⅰ期43例(77.0%), Ⅱ期9例(16.0%), Ⅲ期3例(5.3%), Ⅳ期1例(1.7%)。

1.1.2 主要試劑及儀器: RT-PCR引物、MSP引物: 北京賽百盛基因有限公司; 逆轉錄RNA試劑盒: 美國Foments公司; DNA純化試劑盒: 美國Promega公司; VERITI PCR儀、凝膠成像分析系統: 基因有限公司; DYY-6C電泳儀: 北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 甲基化特異性聚合酶鏈反應(MSP): 取新鮮組織標本100 mg, 放入研磨器中充分研磨，加入消化酶，最后收集到1.5 mL的離心管中進行DNA提取，測定濃度及純度。取DNA標本2 μg嚴格按照DNA純化試劑盒步驟進行純化。DNA經過亞硫酸氫鹽修飾后，沒有發生甲基化的胞嘧啶(C)變為尿嘧啶(U)。而本身發生甲基化的胞嘧啶(C)則保持不變。根據此原理設計引物: Wif-1特異性甲基化引物(MSP): F: 5′-CGCTCCACTGGGCGCACCGC-3′, R: 5′-TCGCACCTCGCTCGCGCCAGC-3′。Wif-1特異性非甲基化引物(USP): F: 5′-GGGTGTTTTATTGGGTGTATTGT-3′, R: 5′-AAAAAAACTAACACAAACAAAATACAAAC-3′。退火溫度分別是: 54 ℃, 50 ℃，產物大小: 145 bp, 154 bp。設置擴增的反應條件: 95 ℃預變性10 min; 95 ℃變性45 s; 退火45 s; 72 ℃延伸50 s, 35個循環后, 72 ℃延伸7 min。擴增后的產物在2%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，用紫外線凝膠電泳成像及圖像分析系統進行圖像分析。將正常人的外周血經SssI甲基化酶處理后作為陽性對照; 菌雙蒸水替代DNA模板進行PCR作為陰性對照。隨機選取10%標本進行重復以確保MSP的可靠性。

1.2.2 逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR): 取新鮮組織每例大約100 mg剪碎研磨，按照Trizol法進行RNA的提取，測定濃度及純度。嚴格按照逆轉錄試劑盒步驟將RNA反轉錄為cDNA, -20 ℃保存備用。以GAPDH作為內參照, RT-PCR引物的設計: Wif-1基因RT-PCR引物: F: 5′-GTCTAAACGGGAACAGCCCT-3′, R: 5′-GCTGGCATTCTCTGTTGTGC-3′。GAPDH: F: 5′-AGGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3′, R: 5′-AGGGGTCATTGATGGCAACA-3′。退火溫度分別是: 48℃, 57℃, 產物大小: 354 bp, 104 bp。cDNA擴增的反應條件: 95 ℃預變性, 10 min; 95 ℃變性, 45 s; 退火, 45 s; 72 ℃延伸, 50 s, 35個循環后, 72 ℃延伸7min, 4℃保存。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠成像儀分析系統下掃描電泳條帶，運用軟件Gel Pro Analysizer 3.1測定條帶灰度值進行半定量分析, Wif-1mRNA相對表達量=Wif-1的灰度值/GAPDH的灰度值。實驗重復3次，最終取平均值。

1.3 統計學分析

用SPSS 17.0軟件包進行數據處理，計數資料采用配對χ2檢驗或Fisher確切概率法，計量資料采用配對或成組設計t檢驗方法。采用雙側檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 RCC組織中的Wif-1基因啟動子甲基化狀態

56例RCC組織及癌旁正常組織均成功進行了MSP檢測(圖1、2)。Wif-1基因啟動子在RCC組織中甲基化率為46.4%(26/56), 顯著高于正常腎組織的甲基化率3.6%(2/56)(P<0.05)。

2.2 RCC組織中Wif-1基因啟動子甲基化與臨床資料之間的關系

Wif-1基因啟動子的甲基化率與性別、年齡、臨床分期及腫瘤大小等臨床資料無顯著關系(P>0.05)。見表1。

2.3 RCC組織中Wif-1基因mRNA相對表達量與臨床資料之間的關系

Wif-1基因mRNA相對表達量與年齡、性別、腫瘤大小及臨床分期等無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 腎癌組織和正常腎組織中Wif-1甲基化狀態

圖2 腎癌組織和正常腎組織中Wif-1基因mRNA和GAPDH相對表達量的分析

表1 腎癌組織Wif-1甲基化和mRNA臨床資料的關系

2.4 RCC組織和正常腎組織中Wif-1基因mRNA相對表達量

Wif-1基因mRNA在RCC組織中的相對表達量(0.65±0.17), 顯著低于正常腎組織mRNA的相對表達量(0.77±0.06),P<0.05。

2.5 Wif-1基因甲基化與表達之間的相關性

在RCC組織中, Wif-1基因甲基化陽性組mRNA的相對表達量(0.68±0.17), 與甲基化陰性組mRNA的相對表達量(0.63±0.17)比較無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

腫瘤發生機制的研究一直都是生命科學研究的熱點，而近年來關于表觀遺傳學改變在腫瘤發生機制中的作用引起越來越多學者的關注。表觀遺傳學最早由Waddington[1]在1939年首先提出，它的提出為腫瘤生物學和癌癥生物標記方面提供了一種新的見解。DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾形式，也是調節基因組功能的重要手段之一。

Wnt信號轉導通路是一條復雜的信號轉導通路，在細胞增殖、分化、凋亡等方面有著極其重要的作用，它由19個分泌型糖蛋白組成，而這些糖蛋白之間的相互作用可能涉及到腫瘤的形成和發展[2]。Wif-1是Wnt信號通路一個重要的負性調節因子，基因位于染色體12p14.3[3], 可編碼高度保守的分泌型蛋白，最初發現表達于人類視網膜上[4], 通過直接與Wnt蛋白結合，阻斷蛋白與受體之間的結合，阻斷了經典和非經典通路，從而可抑因Wnt信號紊亂引起的惡性腫瘤。當Wif-1發生甲基化時，可能會激活Wnt通路，致使核內靶基因轉錄活化，促進細胞的異常增殖和分化。當本研究應用MSP的方法檢測到Wif-1基因在RCC組織中甲基化率為46.4%, 明顯高于癌旁正常腎組織的甲基化率3.6%, 這與Ding等[5]報道肝的癌組織中Wif-1的甲基化率顯著高于癌旁正常組織這一結果相一致，表明甲基化可能參與了腎癌的發生，此外在其他腫瘤同樣報道了存在Wif-1的高甲基化現象，如乳腺癌[6], 膀胱癌[7], 鼻咽癌[8], 結直腸癌[9]。Wissman等[3]用基因芯片技術檢測到在很多人類腫瘤中存在Wif-1表達下調，如前列腺癌、胃腸道腫瘤等，而后在乳腺癌和肺癌應用免疫組織化學的方法檢測到Wif-1蛋白水平的降低。Mazieres等[10]的研究發現在肺癌組織中Wif-1的表達水平顯著低于癌旁組織，且在肺癌組織中甲基化陽性組的表達顯著低于未發生甲基化組，而且Wif-1表達缺失的肺癌細胞株經去甲基化藥物5-氮雜-2′脫氧胞苷(ADC)處理后Wif-1基因可以恢復表達。由此推測Wif-1基因啟動子區的異常高甲基化導致的基因沉默可能肺癌發生的機制之一。本實驗結果表明在腎細胞癌組織中存在Wif-1表達的降低，與上述報道相一致。但是與Mazieres等人實驗結果不太一致是在本實驗56例RCC組織中, Wif-1基因mRNA在甲基化陽性病例中的相對表達量高于甲基化陰性病例中mRNA的相對表達量經統計學分析，差異無統計學意義(P>0.05), 表明其mRNA表達的減低可能由于其他轉錄異常引起的。因此該實驗可以進一步研究腎癌經過去甲基化試劑作用后其表達變化的情況，繼續探討兩者在腎癌中的具體作用機制以及兩者之間的相互關系，為腎癌的發生機制提供更多的理論基礎。

本研究發現腎細胞癌組織中Wif-1基因的甲基化率顯著高于癌旁正常組織，并伴有轉錄水平的降低。因此Wif-1有可能作為腎細胞癌的一個新的分子靶標，對臨床早期診斷與治療發揮一定指導作用。

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Methylation and mRNA expression of Wif-1 gene in renal cell carcinoma

NI Xiaochen, ZHANG Aili, WEI Shufei

(Department of Urinary Surgery, The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei, 050011)

Objective To detect the methylation of Wif-1 gene promoter and its mRNA expression level in renal cell carcinoma, and to explore its possible mechanisms in the development of renal cell carcinoma. Methods The methylation-specific polymerase chain reaction (MSP) and reverse transcription - polymerase chain reaction (RT-PCR) were applied to investigate the methylation status of Wif-1 gene promoter and its mRNA expression levels in renal cell carcinoma (RCC) and normal kidney tissue. Results The percentage of methylation of Wif-1 gene in RCC tissue was significantly higher than that in the corresponding normal kidney tissue (P<0.05). The relative expression quantity of Wif-1 mRNA in RCC tissue was significantly lower than that in corresponding normal kidney tissue (P<0.05). In the RCC tissue, the relative expression of mRNA in the Wif-1 methylation positive group showed no significant difference with that in the methylation negative group. Conclusion Hypermethylation of the Wif-1 promtor in RCC is a frequent phenomenon.

renal cell carcinoma; Wnt inhibitory factor-1; methylation; expression

2017-01-12

張愛莉

R 737.11

A

1672-2353(2017)15-074-04

10.7619/jcmp.201715020