斑馬魚模型在糖尿病研究中的應用

王 雪，韓利文，何秋霞，韓 建，王榮春，陳維云，王希敏，侯海榮，劉可春(山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，濟南 250014)

專題研究

斑馬魚模型在糖尿病研究中的應用

王 雪，韓利文，何秋霞，韓 建，王榮春，陳維云，王希敏，侯海榮，劉可春*
(山東省科學院生物研究所，山東省生物檢測技術工程實驗室，山東省科學院藥物篩選技術重點實驗室，濟南 250014)

作為一種模式生物，斑馬魚具有其他動物模型所不具備的諸多優勢，非常適用于進行人類疾病建模及機制研究。斑馬魚胰腺經歷兩次發育分化過程，其間伴有多種信號途徑的活化參與。成魚的胰腺結構與其他動物胰腺相似，能分泌包括胰島素在內的多種激素。斑馬魚胰腺及對胰島素敏感的肝臟、肌肉等這些與代謝調控相關的主要器官及外周組織，在進化上具有保守性，糖代謝調控機制也與其他哺乳動物相似，這使得斑馬魚非常適用于糖代謝調控研究。除利用STZ誘導胰島β細胞凋亡造成斑馬魚糖尿病模型外，高糖溶液交替暴露及外源性干預代謝相關信號途徑也可以造成斑馬魚血糖升高。成魚血糖水平、幼魚組織糖含量、視網膜及視網膜血管形態變化是目前斑馬魚糖尿病模型研究中的常用檢測指標。

斑馬魚；糖尿病；模式生物；胰腺；糖代謝

糖尿病是一組由多病因引起的、以慢性高血糖為特征的終身性代謝性疾病。糖尿病患者體內長期存在的高血糖狀態，會廣泛導致機體各組織，尤其是眼、腎、心臟、血管及神經等的慢性損害和功能障礙，嚴重危害人體健康。糖尿病是全球流行性疾病，患病率呈逐年增高趨勢，并成為致死和致殘的重要原因，對糖尿病的研究一直是一項世界性的重要課題，但對糖尿病的病因，至今尚未完全闡明。

動物模型是進行人類疾病研究的重要工具，利用動物模型不僅能直觀的體現人類疾病的病理生理改變，進行疾病機制研究，還可以在模型基礎上篩選活性藥物。目前在利用動物糖尿病模型研究糖尿病及其并發癥方面已有大量的報道，其中最為常用的動物是大、小鼠，但還沒有哪種動物模型能完全呈現人類糖尿病臨床癥狀。斑馬魚是一種理想的脊椎模式生物，體格小、產卵量大、生長周期短，成魚養殖簡單，能夠有效提高實驗效率。同時，斑馬魚的基因信息已為人類熟知，針對斑馬魚的基因操作技術已非常成熟，通過靶向性地誘導或敲除體內某些基因，改變其表達水平，可以較容易的在斑馬魚上復制人類的一些疾病狀態，非常適用于進行人類疾病建模及機制研究。而在內分泌腺體功能及糖代謝方面，斑馬魚有其自身的特點及優勢，并已應用于人類糖尿病等代謝類疾病方面的研究，本文對此作一綜述。

1 斑馬魚胰腺發育及生物學特點

自1996年，研究者開始從分子、遺傳及形態學等多個角度對斑馬魚胰腺進行研究[1]。在胚胎早期發育中，斑馬魚胰腺經歷兩次發育分化過程。胰腺第一次發育出現于胚胎受精后24 h(hours post-fertilization，hpf)，主要是形成一些分泌胰島素的細胞[2]，即為初級胰島；5 dpf (days post-fertilization) 時，位于胰腺管內的前體細胞開始轉化并聚集，形成次級胰島，只有在第二次分化中形成的內分泌細胞具有增殖潛能，并形成后來成魚的胰腺[3，4]。與其他脊椎動物一樣，斑馬魚胰腺的內分泌腺及外分泌腺均來源于內胚層。繼內胚層分化及與中胚層分離之后，消化管前后軸的分化是胰腺發育的重要一步，這個過程直接伴隨有多種信號途徑的活化參與，包括Wnt、RA(retinoic acid)、BMP(bone morphogenetic protein), FGF(fibroblast growth factor)和 Hh (Hedgehog)等[5]。每種信號途徑具有不同的作用，這些信號的綜合作用實現了胰腺原基的精確定位，及胰腺一些早期標志物的區域化表達，如Pdx1 因子，研究表明Pdx1 因子在脊椎動物胰腺原基的形成及后期的分化中發揮重要作用。與哺乳動物一樣，斑馬魚胰腺β細胞的分化過程受Notch 信號控制，胰腺內一些對Notch信號敏感的腺管相關的前體細胞(notch-responsive cells，PNCs)，具有分化成β細胞的潛能[6]。同時，幼魚期β細胞的形成與腺管上皮細胞密切相關，研究表明，腺管上皮細胞具有向胰腺β細胞轉化的能力[5]。

與其他動物胰腺的細胞結構一樣，斑馬魚胰腺由一個外分泌腺(腺管結構)和一個內分泌腺組成，其中內分泌腺由α、β、δ和PP 細胞組成，這些細胞分別具有表達分泌胰高血糖素(glucagon)、胰島素(insulin)、 生長抑素(somatostatin)和胰多肽(pancreatic polypeptide)的功能[7，8]。在胚胎發育第一周，斑馬魚胰腺結構簡單，僅有一個胰島[9]。在斑馬魚成魚，一部分胰腺β細胞聚集于胰腺頭部的邊緣部位，形成單個大的胰島，另一部分則形成一些小的胰島，嵌入外分泌腺組織中，并沿胰腺管散在分布[10]。

2 斑馬魚在糖尿病模型研究中的應用

2.1 斑馬魚糖尿病模型的應用基礎及優勢

硬骨魚類體內分布有一些包含激素分泌細胞的內源性腺體，這些腺體分泌產生包括胰島素在內的多種激素，用于機體的代謝調節，研究表明，這些腺體與人類的具有同源性[11]。在斑馬魚，與代謝調控相關的主要器官，如胰腺，及一些對胰島素敏感的外周組織組織肝臟、肌肉等在進化上具有保守性[12]，一些與糖代謝調控相關的關鍵機制與其他哺乳動物非常相似[13]，使得斑馬魚可以作為糖代謝調整控的研究模型，用于人類糖尿病研究[11]。另外，對魚類在碳水化合物利用方面的研究表明，如斑馬魚類生活在溫水、雜食性的硬骨魚對碳水化合物的利用度遠高于生活在冷水、肉食性硬骨魚，其糖代謝速度也比肉食性魚類要快。碳水化合物是斑馬魚食物中的重要成分，斑馬魚生長速度與其含量成正比。一些與糖代謝有關的重要基因如己糖激酶、葡萄糖轉運蛋白基因在斑馬魚體內活躍表達，而這些基因的缺失會引發斑馬魚胚胎發生一系列嚴重的神經缺陷，因此，糖代謝是斑馬魚機體代謝的重要組成部分，斑馬魚是進行糖尿病相關研究的理想模型。

由于基因組部分復制，斑馬魚的許多基因包含兩個相應的直向同源基因，兩個同源基因含的增強子不同，使其在不同的組織存在職能化表達。如胰腺的nkx2.2a、pax6b及jagged1b基因等即存在這一現象[7,14]。利用斑馬魚基因表達的特點，現已構建了大量的斑馬魚突變體及轉基因斑馬魚品系，如綠色熒光轉基因斑馬魚，這種斑馬魚體內的器官或組織細胞能特異表達綠色熒光蛋白，加上斑馬魚幼魚魚體透明的特點，直接在顯微鏡下即可觀察器官形態及組織成分的變化，可以有效的簡化實驗過程，非常適于藥物的高通量篩選。

2.2 斑馬魚糖尿病模型的造模方法

糖尿病動物模型來源有兩種，一種是由于動物自身基因的缺陷自發形成的糖尿病[15]，另一種是通過藥物誘導使動物發生糖尿病。藥物誘導的嚙齒類動物糖尿病模型是目前最常用的，常用藥物有鏈脲佐菌素 (streptozotocin，STZ)和四氧嘧啶(alloxan)，兩者均是通過烷化或誘導DNA破壞造成胰島β細胞凋亡，造成胰島素分泌量不足使血糖升高。嚙齒類動物模型普遍存在成本高、周期長的缺點。

STZ易溶于水，但其水溶液在室溫下極不穩定。Olsen[16]研究中將STZ注入斑馬魚成魚體內，斑馬魚出現血糖升高癥狀，而血液及胰腺中胰島素含量顯著降低。Michael等[17]用同樣方法建立了斑馬魚糖尿病模型，發現在去除STZ后2周內，斑馬魚胰腺β細胞完成再生修復，血糖恢復至正常水平。眾所周知，糖尿病會引起傷口愈合困難，Michael實驗中的糖尿病斑馬魚同樣出現鰭再生及皮膚傷口的愈合障礙，而且，在血糖水平恢復正常后，這種現象仍持續存在[18]，這與臨床糖尿病表現是一致的，即一旦發生糖尿病后，即使通過藥物干預將血糖控制到正常水平，但一些并發癥會依然存在并繼續進展[19]。其他的多項實驗也證明最初的高血糖階段會造成靶器官出現持久的功能異常。這一現象被命名為“代謝記憶效應 (metabolic memory，MM)”。Michael進一步對糖尿病高血糖期及血糖恢復后這兩種狀態下基因的表達情況進行研究，發現這兩種狀態下基因的表達模式發生了相似的改變，這也是血糖恢復正常后仍出現鰭及皮膚再生障礙的原因，即使血糖水平等指征恢復正常，高血糖對靶器官造成的損害仍無法逆轉[17]。

斑馬魚對環境中糖的攝取與滲透壓調節有關，體內高滲狀態使環境中的水分進入體內，葡萄糖隨之攝入體內。Gleeson等[20]利用高糖溶液浸泡法建立斑馬魚糖尿病模型，研究中將斑馬魚交替暴露于無葡萄糖的水與含2%葡萄糖的水溶液中，每24 h更換一次，持續28 d，會導致斑馬魚出現持續高血糖癥狀，在每次浸入2%葡萄糖溶液中時會重復出現血糖峰值。實驗中將斑馬魚持續暴露于含糖溶液中，血糖也出現升高，但這種升高是短暫的，而且連續浸入糖溶液，尤其是高濃度糖溶液中，會導致斑馬魚出現游動及鰓功能異常，甚至出現死亡。

NF-κB是一類核轉錄因子蛋白家族，能調節炎性相關基因的表達，在腫瘤發生與炎癥反應中起重要作用。研究發現，NF-κB經典與旁路兩種信號途徑均與代謝綜合癥相關，與糖尿病中胰島素抵抗及β 細胞功能異常有重要關系。在肥胖病人的肌肉組織中，NF-κB誘導激酶(NF-κB-inducible kinase，NIK)呈高水平狀態，說明NF-κB旁路信號途徑被活化。Malle等[12]利用藥物誘導提高斑馬魚幼魚體內的NIK水平，外源性激活NF-κB旁路信號途徑，6 h后幼魚血糖水平出現顯著升高，說明體內的糖平衡調節功能受到影響。進一步研究發現，藥物處理組幼魚的β細胞功能出現異常，雖然細胞內胰島素能正常生成，但其分泌明顯受阻。

2.3 斑馬魚糖尿病模型的評價指標

血糖水平是反映胰腺β細胞功能的主要指標，也是臨床糖尿病診斷或糖尿病動物模型研究中的常用檢測指標。Stefani等[21]對麻醉后的斑馬魚成魚取血，分別檢測了斑馬魚空腹血糖(fasting)、餐后血糖(feeding)及糖負荷值(a glucose challenge)等指標，以研究斑馬魚體內的糖代謝規律。發現斑馬魚血糖處于動態地自我調節的狀態。禁食2 d時，血糖會出現應激性升高，第3天時即回落到正常水平。注射葡萄糖后30 min內血糖水平升高并達到峰值，在6 h時，血糖又重新回落到正常水平。在斑馬魚血糖檢測中，麻醉方法是影響血糖值的一個因素，多數麻醉劑是神經細胞離子通道阻滯劑[22]，會直接作用于β細胞通道影響胰島素分泌。已有研究稱麻醉劑MS-222會干擾β細胞功能，引起硬骨魚血糖升高[23]。Stefani的實驗中也顯示，MS-222麻醉組斑馬魚血糖的CV值較高，故在其研究中采用低溫麻醉法。一些脊椎動物，包括硬骨魚在內，血糖水平還受性別影響[23]，但Stefani實驗中斑馬魚血糖水平未檢測出性別差異[21]。對于斑馬魚，由于其體格較小，要采集足夠體積的血液樣本比較困難[21]，因此，仍需要尋找一種更為簡易有效的胰島功能評價方法，用于斑馬魚胰腺功能及糖代謝研究。

斑馬魚是進行糖尿病研究的理想模型，但對斑馬魚內源性血糖水平的變化模式及胰島在血糖調節中的作用還不清楚，尤其是斑馬魚胚胎早期是否產生和利用糖，早期胚胎的胰島是否具有調節糖代謝功能仍是未知數。Jurczyk[13]用酶法檢測斑馬魚胚胎裂解物中的葡萄糖絕對含量，獲得了胚胎發育過程中體內糖含量動態變化資料。發現，在斑馬魚發育早期，未檢測到葡萄糖存在，在16 hpf至24 hpf階段內，胚胎體內的葡萄糖含量逐漸上升，并在胰腺內分泌腺分化及胰島形態發育早期達到峰值，這與鼠胚發育過程中的糖動態變化模式非常相似。Jurczyk的研究結果也表明，在胚胎發育早期，胰島具有糖代謝調節功能。

糖尿病視網膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見的微血管并發癥之一，是糖尿病人致盲的主要原因。斑馬魚的視覺系統與人類及其他哺乳動物的非常相似，在斑馬魚能夠清楚的觀察到整個視網膜細胞層結構, 包括從神經節細胞層(ganglion cell layer)到視網膜色素上皮細胞層[24](圖1 B和C)，因此斑馬魚被廣泛用于視覺發育及修復研究中。Gleeson用高糖溶液暴露法建立斑馬魚糖尿病模型，并進行DR研究。對視網膜形態觀察發現，血糖持續升高28 d后，糖尿病模型組斑馬魚內網層 (inner plexiform layer，IPL)和內核層 (inner nuclear layer， INL)均比正常組明顯減少，IPL明顯變薄[20]，這與糖尿病患者及其他糖尿病動物模型中的視網膜病變表現一致。因此，斑馬魚視網膜形態的變化，可作為斑馬魚糖尿病模型研究中的一項觀察指標。

注：A 斑馬魚視網膜血管形態；B和C 視網膜組織結構分層； ONL：外核層；OPL：外叢狀層；INL：內核層；IPL: 內叢狀層；GL: 神經節細胞層；方框：視網膜血管覆蓋于內界膜(the inner limiting membrane，ILM)表面。圖1 斑馬魚視網膜血管形態及視網膜組織結構Note. A: The retinal blood vessels；B,C: Layers of the zebrafish retina；ONL: Outer nuclear layer；OPL: Outer plexiform layer；INL: Inner nuclear layer；IPL: Inner plexiform layer；GL: Ganglion cell layer；The rectangle frame indicates the inner limiting membrane (ILM).Fig.1 Morphology of the retinal blood vessels and histological structure of the zebrafish retina

在DR，高血糖導致視網膜部位的微血管發生病變，同時，視網膜損害會刺激新生血管生長，形成增殖性視網膜病變，因此，視網膜血管形態學觀察是糖尿病研究中一項必不可少的內容。目前，已建立了一些特異的斑馬魚血管生成模型，可以用于DR中視網膜血管的觀察與研究。但是斑馬魚成魚視網膜血管系統比較復雜[25](圖1 A)，內核層血管的三級靜脈叢缺失，視網膜靜脈系統也與人類的不同，因此，在利用斑馬魚進行DR研究時要注意可能帶來的細胞或血管層面的偏差。

3 結束語

動物模型對于研究人類疾病的發病機制、確定藥物靶點及發現新的活性藥物具有重要意義。斑馬魚作為一種脊椎模式生物，具有其他模型所不具備的獨特優勢，非常易于進行轉基因操作及藥物實施。斑馬魚胰腺結構簡單，利用斑馬魚模型，可以在整體動物水平對糖尿病的病理現象及發病機制進行分析，并開展高通量藥物篩選。同時，以早期胚胎為模型，通過正向遺傳藥物篩選技術，可以確定與代謝相關的特異基因、信號途徑或活性化合物。而從斑馬魚模型上獲得的活性藥物或數據，又可以進一步在鼠等其他動物模型中得到驗證。

隨著基因操作技術的發展，現在的研究中已將斑馬魚模型與綠色熒光轉基因技術及Tilling- 或zinc finger介導的靶基因突變技術結合起來，可以更深入地剖析胰腺細胞發育、生長及再生機制，并從分子水平精確分析糖尿病發病機制，以用于糖尿病造模及治療方面的研究。由此可見，在不遠的將來，斑馬魚這一動物模型，將會在包括糖尿病在內的人類胰腺疾病的治療中發揮更重要的作用。

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Application of zebrafish models in research of diabetes

WANG Xue， HAN Li-wen， HE Qiu-xia， HAN Jian， WANG Rong-chun， CHEN Wei-yun， WANG Xi-min， HOU Hai-rong， LIU Ke-chun*
(Institute of Biology, Shandong Academy of Sciences, Shandong Provincial Engineering Laboratory for Biological Testing Technology, Key Laboratory for Drug Screening Technology of Shandong Academy of Sciences, Jinan 250014, China)

As a model organism, zebrafish have many advantages over other animal models and is suitable for studies on establishment of human disease model and mechanism. In zebrafish, there are two phases of endocrine formation during early development, which are directed by concomitant activity of many signaling pathways. Zebrafish pancreas possess similar cell structure with that of other animals, which can express various endocrine hormones including insulin. The main organs required for metabolic control, such as the pancreas, islet, and insulin sensitive tissue (muscle, liver) are conserved in zebrafish, and the mechanisms of glucose regulation in zebrafish is similar to that seen in mammalian models. These render it an excellent model to study glucose metabolism. Hyperglycemia in zebrafish model can be induced by administration of the diabetogenic drug, streptozotocin (STZ), alternatively immersion of the fish in glucose solution and water, or disturbing of signaling pathways associated with glucose metabolism. Glucose levels in adult zebrafish blood or embryo tissue and phenotype of retinal cell layers or retinal vasculature are the commonly used measurement organs in zebrafish diabetic models.

Zebrafish; Diabetes; Model organism; Pancreas; Glucose metabolism

國家自然科學基金資助項目(31400979)；山東省自主創新重大專項(2014ZZCX0215)。

王雪，高級工程師，碩士，研究方向：藥物毒性評價與活性篩選。E-mail: wangxue8809@163.com

劉可春，研究員，博士，研究方向：藥物活性篩選。E-mail: hliukch@sdas.org

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0001-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.001

2016-11-03