2型糖尿病db/db小鼠的生物學(xué)特性

邢 瑋，王政霖，呂甜甜，王宏亮，袁悅瑩，韓 靜，吳 晏

專題研究

2型糖尿病db/db小鼠的生物學(xué)特性

邢 瑋，王政霖，呂甜甜，王宏亮，袁悅瑩，韓 靜*，吳 晏*

糖尿病是嚴(yán)重威脅人類身心健康的慢性代謝性疾病。近年來，糖尿病患者人數(shù)不斷增加，國際糖尿病聯(lián)合會估計(jì)，到2035年預(yù)計(jì)全球糖尿病患者將達(dá)到5.92億[1]。我國糖尿病患病率呈明顯增加趨勢，其中大部分為2 型糖尿病患者[2]。目前，2型糖尿病相關(guān)藥物的研發(fā)已經(jīng)成為熱點(diǎn)，選擇適合的2型糖尿病動物模型對于該疾病的病理機(jī)制研究以及新藥物的研發(fā)都具有非常重要的作用。

db/db小鼠是美國Jackson 實(shí)驗(yàn)室于1966年發(fā)現(xiàn)的位于4號染色體的Leptin 受體基因缺陷導(dǎo)致的自發(fā)性2型糖尿病小鼠，從四周齡即出現(xiàn)貪食、肥胖，隨周齡增加而出現(xiàn)明顯的高血糖、高血脂、胰島素抵抗等特征，其發(fā)病過程與2型糖尿病患者非常相似[3,4]。本研究考察了BKS-DB 小鼠的體質(zhì)量、空腹血糖、空腹胰島素等多項(xiàng)指標(biāo)，并觀察了肝臟、胰腺的病理變化特點(diǎn)，旨在為該品系動物的研究應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

SPF級7周齡雄性自發(fā)性2型糖尿病BKS.Cg-Dock7m +/+Leprdb/JNju小鼠10只，體重為30～40 g，作為模型組；SPF級7周齡雄性(Leprdb)wt/wt野生型(Wild Type)小鼠10只，體重為17～23 g，作為對照組。所有動物均購于南京大學(xué)—南京生物醫(yī)藥研究院[SCXK(蘇)2015-0001]。全部動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)清潔級動物室[SYXK(京)2016-0038]。自由攝食、飲水，室溫20～25℃，晝夜明暗交替時(shí)間12 h/12 h。按3R原則給予實(shí)驗(yàn)動物人道關(guān)懷。

1.2 主要儀器與試劑

Abbott Diabetes Care Ltd生產(chǎn)的Optium Xceed血糖儀及其配套使用的Optium血糖試紙;酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司);全自動生化分析儀(美國Beckman Culter公司);電子顯微鏡(美國Olympus公司)。

胰島素ELISA試劑盒(Millipore 公司生產(chǎn)，批號為EZRMI-13K);總膽固醇試劑盒(酶法，貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)，批號AUZ3694);甘油三酯試劑盒(GPO-POD法，貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司生產(chǎn)，批號AUZ3692)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 體質(zhì)量和血糖值的測定

分別在糖尿病小鼠與野生型小鼠8、12、16、20和24周齡時(shí)測定空腹血糖值。檢測前將小鼠禁食6～8 h，經(jīng)尾靜脈取血，用血糖儀測定小鼠的血糖值。于10、12、16、20和24周齡時(shí)稱取兩組小鼠的體質(zhì)量。

1.3.2 胰島素、總膽固醇和甘油三酯含量的測定

摘取小鼠眼球取血，3000 r/min離心10 min，分離血清，于-80℃冷凍保存，備用。按照試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)方法，分別檢測血清中空腹胰島素(FIN)，總膽固醇(CHO)和甘油三酯(TG)的含量。

1.3.3 肝臟、腎臟大體病變觀察，臟器質(zhì)量和肝臟系數(shù)的測定

解剖小鼠，對肝臟和腎臟進(jìn)行病變觀察。仔細(xì)分離小鼠的肝臟和左側(cè)腎臟，剔除表面脂肪和筋膜后并稱重，肝臟系數(shù)以肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量表示。

1.3.4 組織病理學(xué)觀察

將小鼠的肝臟和胰腺置于4%的多聚甲醛溶液中固定，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量和血糖水平

結(jié)果顯示，db/db小鼠在8周齡時(shí)血糖已經(jīng)明顯高于野生型小鼠，在8、12、16、20和24周齡，db/db小鼠的空腹血糖值均明顯高于同周齡的對照組小鼠(P< 0.01)(見圖1)。

注：與對照組相比，**P < 0.01。圖1 血糖值水平Note.Compared with control group，**P < 0.01.Fig.1 Levels of blood glucose

db/db小鼠在10周齡時(shí)體質(zhì)量明顯高于野生型小鼠，在10、12、16、20和24周齡，db/db小鼠的體質(zhì)量均明顯高于同周齡的對照組小鼠(P< 0.01)(見圖2)。

注：與對照組相比，**P < 0.01。圖2 體質(zhì)量水平Note.Compared with the control group，**P < 0.01.Fig.2 Levels of body weight

2.2 血清FIN、CHO和TG水平

模型組小鼠的血清胰島素、總膽固醇和甘油三酯均明顯高于對照組小鼠水平(P< 0.01)，提示模型動物存在高胰島素血癥和脂質(zhì)代謝紊亂(見表1)。

2.3 肝臟、腎臟大體病變觀察，臟器質(zhì)量和肝臟指數(shù)的測定

24周齡的模型組小鼠可見明顯肥胖，體質(zhì)量明顯高于對照組小鼠(P< 0.01)。

取出臟器后稱重，結(jié)果顯示模型組小鼠的肝臟和腎臟質(zhì)量明顯高于對照組小鼠(P< 0.01)。模型組小鼠的肝臟系數(shù)與對照組相比無明顯差異(見表2)。

2.4 組織病理學(xué)觀察

2.4.1 大體病變觀察

解剖小鼠，可見野生型小鼠肝臟呈紅褐色，質(zhì)軟，有彈性；模型組小鼠的肝臟呈黃褐色，體積明顯增大，油膩感明顯。模型組小鼠的腎臟被大量的脂肪包裹，腎臟體積比野生型小鼠增大。

2.4.2 肝臟組織病理改變

模型組自發(fā)性糖尿病小鼠肝臟組織均可見比較明顯的Ⅱ帶和Ⅲ帶肝細(xì)胞肥大、細(xì)胞漿疏松或空亮，以Ⅲ帶肝細(xì)胞為主的細(xì)胞內(nèi)較多嗜堿性染斑塊狀不定形顆粒(見圖3)。

2.4.3 胰腺組織病理改變

模型組自發(fā)性糖尿病小鼠胰腺組織可見輕微或輕度的胰島增生和肥大，胰島內(nèi)可見比較明顯的胰島細(xì)胞增生、變性或壞死，表現(xiàn)為增生的胰島細(xì)胞胞核偏大、嗜堿性增強(qiáng)，變性的胰島細(xì)胞肥大、核腫脹偏大，壞死的胰島細(xì)胞嗜酸性染增強(qiáng)，核皺縮；胰腺組織的外分泌腺泡均可見明顯的腺泡腔擴(kuò)張(見圖3-B)。

3 討論

db/db小鼠是一種自發(fā)性2型糖尿病嚙齒動物模型，目前被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的實(shí)驗(yàn)室研究中[5]。db/db小鼠在10～14 d出現(xiàn)高胰島素血癥，在4周左右貪食、肥胖，4～8周時(shí)因β細(xì)胞障礙開始出現(xiàn)高血糖，在3～4個(gè)月達(dá)到血糖高峰期。db/db小鼠具有和人類2型糖尿病相似的癥狀，表現(xiàn)為多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥、脂代謝異常等[6]。

表1 血清FIN、CHO和TG水平

注：與對照組相比，**P< 0.01。

Note.Compared with the the control group,**P< 0.01.

表2 臟器質(zhì)量和肝臟系數(shù)

注：與對照組相比，**P< 0.01。

Note.Compared with the control group,**P< 0.01.

注：(A)對照組肝臟(×100)；(B)模型組肝 臟(×100)；(C) 對照組胰腺(×200)；(D)模型組胰腺(×200)。圖3 肝臟和胰腺組織病理變化Note. (A) Liver of control group(×100)；(B) Liver of model group(×100)；(C)Pancreas of control group(×200)；(D) Pancreas of model group(×200).Fig.3 Pathological changes in the mouse liver and pancreas

既往研究中對于db/db小鼠生物學(xué)特點(diǎn)的觀察多集中于20周齡以下，對于超過20周齡的db/db小鼠的病癥特點(diǎn)的報(bào)道較少[7-9]。本次實(shí)驗(yàn)對24周齡db/db小鼠的血糖、血脂、血胰島素水平以及臟器病變情況進(jìn)行觀察，以探討模型動物在此階段的病變特點(diǎn)。

本次實(shí)驗(yàn)通過對于db/db小鼠空腹血糖和體質(zhì)量的連續(xù)檢測，顯示db/db小鼠在8周齡時(shí)血糖已經(jīng)明顯高于野生型小鼠，10周齡時(shí)體質(zhì)量明顯高于野生型小鼠，并始終維持著較高的血糖和體質(zhì)量水平直至觀察結(jié)束。db/db小鼠血清胰島素、總膽固醇和甘油三酯水平均明顯高于對照組小鼠，符合該品系小鼠高胰島素血癥、高脂血癥的病變特點(diǎn)。

db/db小鼠屬于肥胖型自發(fā)性糖尿病小鼠，解剖取材時(shí)可見db/db小鼠的腹部脂肪含量明顯增加，肝臟和腎臟均明顯增大，其肝臟和腎臟質(zhì)量均明顯高于野生型小鼠。HE染色切片觀察肝臟和胰腺的病理變化，提示在24周齡時(shí)，db/db小鼠胰腺和肝臟組織可見明顯病變，主要表現(xiàn)為胰腺胰島細(xì)胞增生、變性，肝臟Ⅱ帶和Ⅲ帶肝細(xì)胞肥大、細(xì)胞漿疏松或空亮。

本研究的結(jié)果顯示， db/db小鼠具有明顯的高血糖、高血脂、高胰島素血癥等2型糖尿病特征，并且可以維持較為穩(wěn)定的高血糖狀態(tài)，符合 2型糖尿病相關(guān)的病理機(jī)制以及新藥創(chuàng)制研究的需要。同時(shí)，在24周齡時(shí)，db/db小鼠的肝臟和胰腺已出現(xiàn)明顯的病理變化，適合進(jìn)行相關(guān)臟器的病變機(jī)制研究。本研究表明db/db小鼠是進(jìn)行2型糖尿病實(shí)驗(yàn)研究的較為理想的動物模型，并為該品系動物的研究應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的 觀察db/db小鼠的生物學(xué)特性，為該品系動物的實(shí)驗(yàn)研究應(yīng)用提供基礎(chǔ)。方法 采用自發(fā)性2型糖尿病BKS.Cg-Dock7m +/+Leprdb/JNju小鼠和野生型小鼠，于8、12、16、20和24周齡時(shí)測定空腹血糖值，10、12、16、20和24周齡時(shí)測定體質(zhì)量，并于24周齡時(shí)測定血清胰島素、總膽固醇和甘油三酯水平，檢測臟器質(zhì)量和肝臟系數(shù)，并進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。結(jié)果 db/db小鼠的空腹血糖值和體質(zhì)量始終維持著較高的水平；血清胰島素、總膽固醇和甘油三酯水平，以及肝臟和腎臟質(zhì)量均明顯高于野生型小鼠；24周齡db/db小鼠的胰腺和肝臟組織可見明顯病理改變。結(jié)論 db/db小鼠具有明顯的高血糖、高血脂、高胰島素血癥等2型糖尿病特征，是進(jìn)行2型糖尿病實(shí)驗(yàn)研究的理想的動物模型。

db/db小鼠；2型糖尿病；生物學(xué)特性

Biological characteristics of a db/db mouse model of type 2 diabetes

XING Wei， WANG Zheng-lin, LV Tian-tian， WANG Hong-liang， YUAN Yue-ying， HAN Jing*， WU Yan*
(Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China)

Objective To observe the biological characteristics of db/db mice, and to provide the basis for application of db/db mice in experimental research. Methods Spontaneous type 2 diabetes BKS.Cg-Dock7m +/+Leprdb/JNju mice and wild type mice of the same age were used in this study. Their fasting blood glucose was determined at 8,12,16, 20 and 24 weeks of age, the body weight was recorded at 10, 12,16, 20 and 24 weeks of age, the levels of serum insulin, total cholesterol and triglyceride were measured, the organ weight and liver coefficient were determined, and the liver and pancreas were taken for pathological examination at 24 weeks of age. Results The db/db mice maintained a high level of fasting blood glucose and body weight. Levels of serum insulin, total cholesterol, and triglyceride were significantly higher than the wild type mice. Compared with wild type mice, liver weight and kidney weight were also significantly increased. Obvious pathological changes of liver and pancreas were observed in 24-week old db/db mice. Conclusions db/db mouse has obvious characteristics of type 2 diabetes, such as hyperglycemia, hyperlipidemia, and hyperinsulinemia, can maintain stable levels of high blood glucose,and is an ideal animal model for experimental study of type 2 diabetes mellitus.

db/db mice; Type 2 diabetes; Biological characteristics

國家自然科學(xué)基金(81303083)。

邢瑋，女，碩士研究生，研究方向：糖尿病的中藥藥理研究。

韓靜，副研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病的中藥藥理研究；吳晏，副研究員，研究方向：糖尿病的中藥藥理研究，E-mail:nayattmm@vip.sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0012-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.003

2016-12-20