PKH26和Hoechst 33258聯合示蹤Uncv無毛小鼠iRhom2及其突變體蛋白

游 穎，陳丙波*，曾 林

研究報告

PKH26和Hoechst 33258聯合示蹤Uncv無毛小鼠iRhom2及其突變體蛋白

游 穎1，陳丙波1*，曾 林2*

軍事醫學科學院實驗動物中心在國內首次發現并成功培育成群的被毛突變小鼠。該被毛異常是由位于常染色體上的單基因突變所引起，呈不完全顯性遺傳[1-3]。通過基因連鎖分析最終確定突變基因位于小鼠11號染色體的 D11mit338 和 D11mit337 之間，并通過基因組掃描方式定位了突變基因iRhom2[4]。UNCV無毛突變系小鼠的iRhom2基因的N端309 bp的缺失，導致了無毛性狀的產生[5,6]。本課題組前期構建了穩定表達Uncv無毛小鼠iRhom2及其突變體iRhom2mut蛋白的細胞系。在此基礎上，本研究采用PKH26 和Hoechst33258聯合標記野生型iRhom2及iRhom2mut的穩定細胞系，通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察目的蛋白的定位情況。

注：(A,E)Hoechst 33258染色；(B,F)GFP-蛋白；(C,G)PKH26染色；(D,H)merge。圖1 野生型iRhom2和iRhom2mut蛋白的亞細胞定位Note.(A,E)Hoechst 33258-stained；(B,F)GFP-Protein；(C,G)PKH26-stained；(D,H)merge.Fig.1 Subcellular localization of wild iRhom2 and mutant iRhom2 proteins in the Vero cells

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細胞膜熒光染料PKH26和Hoechst 33258細胞核熒光染料均購自美國Sigma公司；PBS購自Sigma公司；DMEM細胞培養基購自Hyclone公司；激光共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 PKH26對細胞膜的染色

胰酶消化細胞形成單細胞懸液；用DMEM培養基將細胞洗滌(確保所有操作都在25℃進行)；400 rpm離心5 min將細胞團離散開；棄掉上清液，剩余的上清液需小于25 μL；加入1 mL的稀釋液，使細胞重新離散；在無菌EP管中，用無水乙醇在25℃條件下對PKH26染色液進行稀釋；快速將細胞和PKH26染料混合起來；25℃下進行孵育1～5 min，偶爾搖晃保證其充分混勻；以1∶1的體積比，加入血清使其正常的反應停止，終止反應時間為1 min；加入等量的含血清的細胞培養基對中止反應液進行稀釋；400 rpm轉25℃，離心10 min后，棄掉離心后的上清；細胞團轉入新試管中，進一步洗三次；加10 mL細胞培養液，離心，把細胞懸浮至所需要的濃度。

1.2.2 Hoechst 33258對細胞核的染色

將制備得到的細胞懸液，用醋酸-乙醇固定；用0.01 mol/L 緩沖液洗滌5 min；將Hoechst 33258染色液配制為工作濃度，在常溫下使其與細胞作用15 min，從而對細胞核進行染色；0.01 mol/L緩沖液洗滌3次，一次約5 min；將染色好的細胞加入confocal皿中，并滴加少量的PBS，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察

對掃描參數進行設置，這主要包括對Mode和Channel兩種模式的設置。在Mode模式下，可以轉換鏡頭，掃描分辨率、速度，選擇掃描范圍，設置掃描范圍復位。進行完相應設置后，開始掃描圖像，最后將得到的圖片保存備用。

2 結果

PKH26在波長為551 nm的激發光作用下發出紅色熒光，Hoechst 33258在波長為340 nm的激發光作用下發出藍色熒光。在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察，發現野生型組可見到綠色熒光彌漫于紅色熒光，突變型組綠色熒光廣泛分布于紅色熒光中，但在藍色熒光中也出現少許。提示野生型iRhom2分布于細胞漿中，iRhom2mut分布于細胞漿和細胞核內。(見圖1)

3 討論

為了確保細胞的正常生理活動，其特定蛋白的合成以及運輸都是既定的[7]。所以，有差別的蛋白質往往分布于細胞的不同部位，它們必須在特定的部位發揮的特定功能。

蛋白質的亞細胞定位是研究其功能的重要手段，特別是對大型基因組序列的分析來說，一個全自動而且又可靠的蛋白質亞細胞定位預測系統是必要的。預測蛋白定位的途徑：一是基于蛋白的N端信號的識別，另一個是基于氨基酸的組成[8,9]。

PKH26染色液能對多種細胞(動植物細胞和其他胞膜)進行有效標記，同時對細胞的生存活力沒有影響，基于此，PKH26多用于研究細胞的增殖、遷移等[10-12]。而Hoechst 33258核染色液可以經過牢固的細胞膜，從而與DNA結合。由于Hoechst 33258在461 nm處發出靛藍色的熒光，因此Hoechst多被用來標記活細胞的細胞核。由于有效結合DNA后，會干擾DNA復制以及細胞分裂，所以該染料具有導致癌癥和畸形的風險[13-15]。

本研究采用PKH26與Hoechst 33258聯合染色研究iRhom2蛋白的細胞內定位。發現野生型iRhom2蛋白位于胞漿，iRhom2mut位于胞漿和胞核。根據本實驗結果，預測iRhom2的N端缺失影響其亞細胞定位。然而，從軟件預測結構來看，該缺失突變不影響其亞細胞定位。原因可能是因為iRhom2mut有小部分轉移到了細胞核上，或者iRhom2mut的亞細胞定位在不同的組織或者細胞類型中是不一樣的。同時，iRhom2mut突變基因可能有新功能，通過調節信號通路影響其亞細胞定位，但其具體的機制，有待于后續的探索。

[1] Comisford R, Lubbers ER, Householder LA, et al. Growth hormone receptor antagonist transgenic mice have increased subcutaneous adipose tissue mass, altered glucose homeostasis and no change in white adipose tissue cellular senescence [J]. Gerontology, 2016, 62(2): 163-172.

[2] Li SR, Wang DP, Yu XL, et al. Uncv (uncovered): a new mutation causing hairloss on mouse chromosome 11 [J]. Genet Res, 1999, 73(3):233-238.

[3] Hassab-El-Naby HM, Tam S, White WL, et al. Mixed tumors of the skin: a histological and immunohistochemical study [J]. Am J Dermatopathol, 1989, 11(5): 413-428.

[4] Foster HL, Small JD, Fox JG, et al. The Mouse in Biomedical Research: Normative biology, immunology, and husbandry [M]. Academic Press, 1982.[5] Botchkarev VA, Eichmüller S, Johansson O, et al. Hair cycle-dependent plasticity of skin and hair follicle innervation in normal murine skin [J]. J Comp Neurol, 1997, 386(3): 379-395.

[6] Gooz M. ADAM-17: the enzyme that does it all [J]. Crit Rev Biochem Mol Biol, 2010, 45(2): 146-169.

[7] Bannai H, Tamada Y, Maruyama O, et al. Extensive feature detection of N-terminal protein sorting signals [J]. Bioinformatics, 2002, 18(2): 298-305.[8] Nakai K, Horton P. PSORT: a program for detecting sorting signals in proteins and predicting their subcellular localization [J]. Trends Biochem Sci, 1999, 24(1): 34-36.

[9] Ohno H, Stewart J, Fournier M C, et al. Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins [J]. Science, 1995, 269(5232): 1872-1875.

[10] Orozco AF, Lewis DE. Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma [J]. Cytometry Part A, 2010, 77(6): 502-514.

[11] Li T, Zheng J, Xie Y, et al. Transplantable neural progenitor populations derived from rhesus monkey embryonic stem cells [J]. Stem Cells, 2005, 23(9): 1295-1303.

[12] Lee-MacAry AE, Ross EL, Davies D, et al. Development of a novel flow cytometric cell-mediated cytotoxicity assay using the fluorophores PKH-26 and TO-PRO-3 iodide [J]. J Immunol Methods, 2001, 252(1): 83-92.

[13] Orozco A F, Jorgez C J, Horne C, et al. Membrane protected apoptotic trophoblast microparticles contain nucleic acids: relevance to preeclampsia [J]. Am J Pathol, 2008, 173(6): 1595-1608.

[14] Yang Q, Peng J, Guo Q, et al. A cartilage ECM-derived 3-D porous acellular matrix scaffold for in vivo cartilage tissue engineering with PKH26-labeled chondrogenic bone marrow-derived mesenchymal stem cells [J]. Biomaterials, 2008, 29(15): 2378-2387.

[15] Hoechst B, Ormandy LA, Ballmaier M, et al. A new population of myeloid-derived suppressor cells in hepatocellular carcinoma patients induces CD4+CD25+Foxp3+T cells [J]. Gastroenterology, 2008, 135(1): 234-243.

(1.第三軍醫大學實驗動物中心，重慶 400038； 2.軍事醫學科學院實驗動物中心，北京 100071)

目的 利用PKH26和Hoechst 33258聯合示蹤Uncv無毛小鼠iRhom2及其突變體蛋白在Vero細胞中的定位。方法 用PKH26對細胞膜進行染色，同時用Hoechst 33258染料對細胞核進行染色，置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。結果 通過激光共聚焦熒光顯微鏡觀察目的蛋白，發現野生型iRhom2分布在細胞的胞漿，而iRhom2mut于細胞漿內和細胞核內都存在。結論 亞細胞定位的不同推測到iRhom2的N末端缺失突變可能對其細胞內的定位有影響。

PKH26；Hoechst 33258；iRhom2；定位

PKH26 combined with Hoechst 33258 to trace theiRhom2 gene and its mutant proteins of Uncv mice in Vero cells

YOU Ying1， CHEN Bing-bo1*， ZENG Lin2*
(1.Laboratory Animal Center, the Third Military Medical University, Chongqing 400038, China； 2.Laboratory Animal Center, the Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071)

Objective To determine the localization ofiRhom2 and its mutant proteins of Uncv mice in Vero cells by PKH26 combined with Hoechst 33258 staining. Methods The cell membrane was stained with PKH26, and the nuclei were stained with Hoechst 33258 dye, and observed by laser scanning confocal microscopy. Results It was found that wild iRhom2 was distributed in the cytoplasm, and its iRhom2mutwas present both in cytoplasm and cell nuclei. Conclusions The results of our study suggest that a deletion in N-terminal ofiRhom2 affects its subcellular localization.

PKH26; Hoechst 33258; iRhom2; localization; Vero cells; Subcelluoar localization; Uncv mice

國家自然科學基金重點項目(31030058)；國家科技支撐計劃(2011BA115B03)。

游穎(1990-)，女，碩士研究生，研究方向：實驗動物分子遺傳。E-mail： youying0723@163.com

陳丙波(1964-)，男，教授，碩士生導師。E-mail： chenbb81@126.com；曾林(1965-)，男，研究員，博士生導師。E-mail： zenglin1965@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0040-03

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.008

2016-12-27