微衛星DNA分析國內24個近交系小鼠遺傳狀況

李銀銀，吳紹亮，王 洪，蕭曉琴，張雙悅，郭 萌，李長龍，呂建祎， 劉 欣，陳振文，杜小燕*

研究報告

微衛星DNA分析國內24個近交系小鼠遺傳狀況

李銀銀1，吳紹亮2，王 洪3，蕭曉琴4，張雙悅4，郭 萌1，李長龍4，呂建祎4， 劉 欣4，陳振文4，杜小燕1*

近交系小鼠具有遺傳均一性的特點，以及對各種反應的一致性、可再現性、敏感性等均比較好的特點，廣泛應用于醫學生物學各項研究中。其遺傳的同源性、穩定性和可辨性使不同地區的研究結果具有更高的可比性。對近交系小鼠的遺傳質量控制，直接影響著動物實驗結果的準確性、可重復性和科學性[1]。而遺傳檢測是保證實驗動物遺傳質量的重要措施。對近交系的遺傳監測檢測主要是通過測定其基因的純合性和表型品系內的一致性，證實該品系是否保持原來的遺傳特性，是否發生基因突變或基因污染[2]。目前我國實驗動物遺傳檢測國標中主要對生化位點檢測近交系遺傳狀況的方法有較為詳細的規定，對分子生物學的方法如微衛星DNA標記(microsatellite marker)等方法沒有推薦的位點和操作標準。微衛星一般由1～6 bp核苷酸的串聯重復片段構成，重復10～60次左右，廣泛存在于真核細胞基因組中。平均每10 kb就出現一個STR(short tandem repeat)[3]。微衛星因數量多、分布廣、多態性豐富、呈共顯性遺傳方式以及檢測快速方便等優點而備受推崇[4]，已作為衡量人類和動物基因組整體穩定性的良好指標，且在近交系小鼠遺傳監測中得到廣泛應用。國內關于利用微衛星方法檢測近交系小鼠的報道也有很多，涉及到的品系包括BALB/c、C57BL6、TA1、TA2、T739、SCID、M615、C3H和DBA等，選取的微衛星位點也從幾個至幾十個不等[5-8]。為了進一步開展近交系小鼠遺傳檢測的標準化研究，本試驗選取分布于小鼠20條染色體上的30個微衛星位點對國內包括常用品系和基因修飾品系共24個近交系小鼠品系進行遺傳檢測，以期對近交系小鼠微衛星檢測技術進行較系統的研究，為該方法在近交系小鼠遺傳質量檢測中的廣泛應用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

選取國內較常用的近交系小鼠品系和部分基因修飾小鼠品系共24個近交系小鼠品系，分別來自北京(4家單位)、天津、上海、廣州4個地區，均為清潔級或SPF級。樣品來源、編號、品系名稱、性別及動物數目等信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠基因組DNA的制備

取上述24個小鼠品系動物的肝臟組織或者鼠尾0.1 g，加入DNA裂解抽提緩沖液2 mL，加入20 mg/mL蛋白酶K 20 μL，RNA酶10 μL，45℃～55℃消化過夜，酚-氯仿法提取組織DNA，沉淀后，加入TE緩沖液進行溶解。經Nanodrop 2000 C微量分光光度計檢測吸光度A260/A280比值在1.8～2.0之間，檢測樣品合格。取DNA原液適量稀釋成50～100 ng/μL作為DNA模版，于4℃保存備用。

1.2.2 微衛星位點的選擇與引物的合成

本研究所用30個微衛星位點從相關文獻中選取[9]，位點的選擇盡量均勻分布于小鼠的1～20號染色體上，且具有較高的多態性。熒光引物委托上海生工有限公司合成。位點PCR條件前期已經過優化。其中30個位點名稱、引物標記熒光名稱、等位基因數及等位基因范圍如表2中所示。

1.2.3 PCR擴增

PCR反應體系：總反應體系20 μL，其中：10×PCR buffer 2 μL，dNTP Mg2+plus(100 μmol/L)1.2 μL，上下游引物(100 μmol/μL)各0.1 μL，Taq 酶(5 U/μL) 0.1 μL，50～100 ng/μL基因組DNA 1 μL，雙蒸水(ddH2O)15.5 μL。

PCR反應程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s；不同位點54℃～64℃不同溫度退火30 s；72℃延伸30 s；35個循環；72℃繼續延伸 8 min；擴增產物于4℃保存。[9]

1.2.4 PCR產物STR掃描

擴增產物應用STR掃描儀進行掃描，一次掃描可以同時掃描三個微衛星位點，三個位點分別用三種熒光 FAM、HEX、TAMRA進行標記[10]，這三個位點對同一個小鼠樣品的PCR擴增產物按照1∶3∶5 體積比混合后取1 μL上樣，進行STR掃描。

掃描結果由GeneMarker V2.2.0軟件判讀141個樣本在30個微衛星位點的擴增片斷大小。每個位點的等位基因根據擴增片斷大小從大到小順序排列記錄為A、B、C、D等，每個樣本的基因型即可記錄為AA、BC、AC等形式。[9]

表1 24個小鼠近交品系樣品來源、編號、品系名稱、性別、數目

表2 30個微衛星位點名稱、引物標記的熒光名稱、在24個近交系中檢測到的等位基因數及等位基因范圍

2 結果

2.1 STR掃描結果

PCR產物在STR掃描儀上掃描，不同熒光標記顯示不同顏色的掃描圖形。FAM熒光標記的顯示出藍色峰形，HEX熒光標記的顯示出綠色峰形，TAMRA標記的顯示出黑色峰形。同一個DNA樣品用三個不同位點擴增的PCR產物即可同時檢測，在30 bp左右大小間隔。顯示如圖1。在24個近交品系中基因分型得到的等位基因數和等位基因片段大小見表2。在品系間30個位點都呈現了多態性，位于小鼠17號染色體上的D17Nds3位點具有10個等位基因，D6Mit102、D13Mit3、D5Mit48三個位點分別具有9、8、8個等位基因，同樣具有較高的多態性。等位基因數目最少的是D9Mit21、D4Mit23、D14Mit3等3個位點，只有2個等位基因型。

注：(A)D4Mit235位點的TAMRA標記的峰形 圖;(B)D2Mit15位點的HEX標記的峰形 圖;(C)D9Mit23位點的FAM標記的峰形圖。圖1 三個不同位點不同熒光標記PCR產物同 時檢測的峰形圖Note.(A)TAMRA of D4Mit235；(B)HEX of D2Mit15；(C)FAM of D9Mit23.Fig.1 The peak forms of PCR products in a 3-plex fluorescent-PCR of 3 loci

2.2 各品系小鼠微衛星檢測結果

30個微衛星位點引物對141只近交系小鼠樣本的PCR擴增產物，經STR掃描后都出現了典型的波形。通過判讀STR掃描結果，對不同樣品進行等位基因分型。其等位基因分型結果如表3中所示。從表中可以看出，在24個近交品系中，有16個品系17個群體(分別是NCPC/2、db/db、615、NOD/LtJ、CBA/J、DBA/1(北京4)、129(北京3)、129(北京4)、TA1、MRL/LPR、C3H/HeJ、BALB/c、SCID、DBA/2、SCID-BG、A2A-2-B6和EGFP-B6品系，占總檢測品系數的66.7%)在30個位點上均表現為純合基因型，在6只樣品間呈單態性。而其余品系的9個群體(分別是 SAMP8、DBA/1(北京3)、TA2、NOD-SCID、BALB/c-NU、C57BL/6J、FVB、EYFP-B6和C系-FVB)，在個別位點上出現了雜合基因型，或/且在6只樣品間呈多態性，例如BALB/c-NU在D13Mit3位點上有2只動物基因型為雜合的BC型，而且在6只動物間是多態性的。

表3 24個品系30個微衛星位點等位基因STR掃描結果

動物內出現多態的品系數目Numbersofpolymorphicstrains2020203522品系StrainsD5Mit48D17Nds3D19Mit3D16Mit9D7Mit12D18Mit19D8Mit14D15Mit15D17Mit11D18Mit9位點多態數目NumbersofpolymorphiclociNCPC/2EEFFBBBBBBBBCCCCBBDD0db/dbCCGGDDDDCCDDBBAAFFAA0615CCAADDBBEEDDAAAABBBB0NOD/LtJCCJJDDDDDDBBBBDDDDDD0CBA/JBBCCDDDDBBBBBBAABBDD0SAMP8CCDDCCBBCCEEBBDDBBAA2DBA/1?北京3CC(DD)JJ(EE)DDDDCC(AA)BB(DD)BBDDDD(FF)DD19DBA/1?北京4CCJJDDDDCCBBBBDDDDDD0129?北京3GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0129?北京4GGEEBBDDEEEEAAAACCCC0TA1DDFFAADDEEDDCCEEFFAA0TA2DD(CC)EE(JJ)DDDDAA(CC)DD(BB)BBDDFF(DD)DD19NOD?SCIDHHFFDDDDEEDDCCDDAADD1MRL/LPRAAAADDDDBBEECCDDBBDD0C3H/HeJCCBBDDCCEEAACCAABBDD0BALB/c?NUDDHHDDDDEEAC(AA+CC)AAAAEEDD2BALB/cEEHHDDDDEECCAAAAFFDD0SCIDFFIIDDDDEEAAAAAAFFDD0C57BL/6JCCEEDDAAEEDDBBAABBAA1DBA/2CCHHDDDDCCAABBDDFFDD0SCID?BGDDIIDDDDEEAAAAAAFFDD0FVBDDJJDDDDEEBBCCDDAAAA1A2A?2?B6CCEEDDAAEEDDBBBBBBAA0EGFP?B6BBEEDDAAEEDDBBAABBAA0EYFP?B6CCEEDDAAEEDDBBAABBAA1C系?FVBDDJJDDDDEEBBCCEEAAAA1動物內出現多態的品系數目Numbersofpolymorphicstrains2200230020

注：AA(CC)表示多態位點，括號內為多態等位基因型；基因型前面的數字表示多態樣品數目，沒有數字表示只有一個多態樣品。

Note. AA(CC) means the polymorphic loci and the letters between the brackets represent the polymorphic alleles. The number before allele represents the times that polymorphic loci occurs. No number after allele means only one sample is polymorphic.

3 討論

目前使用微衛星位點對小鼠遺傳檢測的研究較多，張樹輝等[11]用42個位點對9種近交系小鼠DNA的多態性進行了研究，謝建云等[12]用24個位點檢測14個品系近交系小鼠，王洪等[5]用20個位點檢測11種近交系小鼠，結果都證實了分子遺傳標記比生物化學法更準確、可靠，可用于常規檢測近交系小鼠遺傳質量[13]。與已有研究相比，本實驗所選的微衛星位點數和檢測的近交系品系數量均比較多，而且本研究用的30個微衛星位點，分布在小鼠的1～20號染色體上，在本實驗中對近交系小鼠進行檢測的結果說明，能夠較好的反映近交系小鼠的遺傳特性。在這30個微衛星基因位點上，共檢測到135條條帶，即135個等位基因型，比用封閉群檢測得到的等位基因型數量少[9]，但是等位基因片段的范圍有所擴大，如在D6Mit102位點由131～177擴大到123～173片段大小。

從理論上講，品系間多態性越好的位點越適合進行品系鑒定，從表3的結果也可以看出，用這30個位點可以對24個品系進行區分，如用D6Mit102位點就可以將FVB、TA1、NOD/LtJ、C57BL/6J、MRL/LPR、SAMP8、BALB/c、NOD-SCID、C3H/HeJ等9種品系從分子水平進行鑒定，因為這些品系在該位點具有特有的基因型。用具有10個等位基因型的D17Nds3位點也可以對多個品系進行鑒定。即使對基因修飾動物與背景動物也可以用這微衛星進行鑒別，例如以3個基因修飾近交品系A2A-2-B6、EGFP-B6、EYFP-B6在D13Mit3和D6Mit8這兩個位點的基因型和背景品系C57BL/6J不同，由此將它們和背景動物區分開來。

從位點特性分析的結果顯示，有一些位點是容易發生突變或呈現多態性的，有20個位點在至少1個品系的動物間出現了多態性，最高的為D7Mit281位點，在5個品系動物間均出現了多態性的特征，分別是FVB、C系-FVB、TA2、DBA/1(北京3)、C57BL/6J。其次是D6Mit102和D13Mit3位點分別在4個品系的動物間出現了多態性的特征，D6Mit9和D18Mit19兩個位點分別在3個品系的動物間出現了多態性的特征，這些位點在用微衛星進行近交系遺傳質量檢測時要引起注意和適當選擇。

本研究所用30個微衛星位點是本團隊進行封閉群小鼠群體遺傳分析時篩選到的位點[9]，從表3中可以看出，在24個所檢測的品系(來源于26個群體)中，大多數品系內的6只動物間都保持了單一基因型的特征，但是有幾個品系在品系內有兩個基因型，出現同一品系內部存在多態性的結果，表明該品系在保種育種過程中可能出現基因污染，或傳代過程中可能發生變異。如TA2和DBA/1(北京3)在多個位點上是多態的，且這兩個品系中都是同一只動物出現多態的等位基因型，表明這品系內的這只動物可能發生了遺傳突變或基因污染。因此，在篩選微衛星位點進行小鼠遺傳檢測時，要綜合考慮近交系動物本身的特征來進行選擇。在以B6為背景的突變系中，A2A-2-B6品系在D10Mit12、D15Mit15兩個位點與背景不同，EGFP-B6品系在D10Mit12、D13Mit3、D5Mit48這3個位點與背景不同，而EYFP-B6品系在D10Mit12位點與背景不同，在D13Mit3位點出現6個樣品中有一個與背景不同。表明這些突變系可能與背景存在微衛星多態性差異。在以FVB為背景的突變系小鼠中，C系-FVB品系在D7Mit281和D15Mit15兩個位點中也出現多態性。這些位點既可以參考作為基因修飾動物與背景動物的鑒別，也說明這幾個位點可能在制備基因修飾動物的過程中可能發生變異的概率較大，不易維持原有等位基因。而在不同單位來源的同一品系可能由于亞系出現而產生差異，如來自北京3和北京4兩個單位的DBA/1出現多態性，可能就是長期分開繁殖而產生了差異。

綜上所述，本研究所選取的30個位點可參考用于國內常用和基因修飾近交系小鼠的遺傳檢測，對其遺傳質量進行適當的評價，也可針對多個品系進行品系檢測鑒定。

[1] 劉先菊,王艷榮.常用近交系小鼠微衛星DNA多態性的分析研究[J].實驗動物科學,2010,27(5):1-4.

[2] 蔡武衛.實驗動物的遺傳質量控制及其意義[J].海峽預防醫學雜志,1997,3(3):68-69.

[3] 楊衛紅,王純耀.近交系小鼠微衛星位點的多態性觀察[J].鄭州大學學報(醫學版),2007,42(1):84-86.

[4] 儲明星,王吉振,工愛國，等.小尾寒羊五個微衛星基因座遺傳多念性研究[J].遺傳學報,2002,29(6):502-505.

[5] 王洪,岳秉飛,劉雙環，等.小鼠11個品系20個微衛星基因位點的遺傳分析[J].中國比較醫學雜志,2006,16(3):135-138.

[6] 陳振文,歐陽兆和.用微衛星標記技術對國內BALB/c小鼠遺傳質量的分析[J].遺傳,2004,26(6):845-848.

[7] 歐陽兆和,陳振文.微衛星DNA多態性在十種近交系小鼠遺傳監測中的應用研究[J].中國比較醫學雜志,2004,14(2):71-74.

[8] 吳寶金,茅慧華,朱紅，等.小鼠39個微衛星的PCR 條件及其運用[J].中國實驗動物學報,2003,11(4):216-220.

[9] 王洪,杜小燕,徐平，等.上海KM小鼠種子群體遺傳狀況分析[J].中國比較醫學雜志,2014,24(12):27-32.

[10] 劉洋,姜麗華,汪運山.微衛星DNA的測定方法[J].中國誤診學雜志,2003,3(7):994-995.

[11] 張樹輝,魏泓,史景泉.近交系小鼠微衛星DNA多態性的研究[J].遺傳,2000,22(6):375-378.

[12] 謝建云,邵偉娟,胡建華，等.微衛星技術對近交系小鼠遺傳質量的分析[J].中國比較醫學雜志,2007,17(9):511-515.

[13] 韓喜彬,蘇玉虹.遼寧省6種常用近交系小鼠10個微衛星位點的遺傳質量檢測報告[J].中國比較醫學雜志,2011,21(5):22-25.

(1.首都醫科大學基礎醫學院實驗動物學系,北京 100069； 2.山東省臨沭縣人民醫院,山東 臨沂 276700； 3.中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所，北京 100050； 4.首都醫科大學基礎醫學院遺傳學系,北京 100069)

目的 利用微衛星位點對國內24種近交系小鼠進行遺傳狀況分析。方法 用前期篩選的富含多態性和等位基因數多的30個小鼠微衛星位點，合成熒光標記引物，對近交系小鼠基因組DNA進行PCR的擴增，經STR掃描對各近交系小鼠品系進行基因分型。結果 在24個近交系小鼠品系中，有16個品系在品系內在30個位點上均具有相同基因型。而在不同品系間同一位點具有多態性，可初步對不同品系進行鑒別區分。其余品系內個別動物存在多態性。結論 所選位點可以參考用于近交系小鼠遺傳質量檢測分析，并進行初步品系檢測鑒定。

近交系小鼠；遺傳質量分析；微衛星DNA

Genetic quality analysis of 24 domestic inbred mouse strains by microsatellite DNA

LI Yin-yin1， WU Shao-liang2， WANG Hong3， XIAO Xiao-qin4， ZHANG Shuang-yue4， GUO Meng1， LI Chang-long4， LV Jian-yi4， LIU Xin4， CHEN Zhen-wen4， DU Xiao-yan1*
(1.Department of Laboratory Animal, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069,China； 2.People's Hospital of Linshu County, Shangdong Linyi 276700； 3.Institute of Laboratory Animal Resources, National Insitute for Food and Drug Control, Beijing 100050； 4.Department of Genetics, School of Basic Medical Sciences, Capital Medical University, Beijing 100069)

Objective To analyze the genetic quality of 24 domestic inbred strains mice using microsatellite loci panel. Methods Previously selected 30 microsatellite loci of mouse with high polymorphism and more allele numbers were used to synthesize corresponding fluorescently-labeled primers. Then the genomic DNA samples of each mouse were amplified by PCR and the products were analyzed by STR scanning to genotype the inbred strains of mice. Results Out of the 24 inbred strains, 15 inbred strains showed the same genotype within one strain at 30 loci. Among different strains, microsatellite loci indicated polymorphism which could be used to distinguish different strains. However, the rest 9 strains demonstrated polymorphism within strains. Conclusions Our stuoly provides a useful microsatellite panel to detect genetic quality of inbred mice and distinguish different strains with the optimized microsatellite loci.

Inbred strains; Mice; Genetic quality; Microsatellite DNA

國家科技支撐計劃(2015BAI07B01)；國家自然科學基金(31372272，31572341)。

李銀銀(1989-)，女，碩士研究生，專業：實驗動物學。E-mail： yyl7590@163.com

杜小燕(1971-)，女，博士，副教授，研究方向：實驗動物教學和研究。E-mail： duduyan@ccmu.edu.cn

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0043-07

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.009

2016-11-29