氣囊對腹壁撤退反射實驗結果的影響

趙 妍，周思遠*，羅丹妮，陳 穎，黃 辰

研究報告

氣囊對腹壁撤退反射實驗結果的影響

趙 妍，周思遠*，羅丹妮，陳 穎，黃 辰

內臟高敏感性是功能性胃腸病的重要臨床表現之一[1]，在功能性胃腸病的動物模型研究中，內臟高敏是否存在也是評價模型成功和穩定性的重要指標。目前評價內臟高敏模型是否成功的方法主要有腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex，AWR)評分和腹外斜肌放電實驗[2]。相較于腹外斜肌放電實驗的有創性操作，腹壁撤退反射評分在動物實驗中應用更為廣泛。腹壁撤退反射評分，即通過肉眼觀察受刺激大鼠的腹肌收縮強度,并給出評分[3,4]。測試時通常采用20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg、80 mmHg 4個壓力值對大鼠腸壁進行刺激，根據大鼠的反應從0到4有不同評分。腹壁撤退反射實驗目前沒有統一的測量裝置及標準，現有的報道多為實驗者自己制作測試裝置，裝置涉及多個環節，其中對測試結果影響最大的是氣囊的制備。通常用作氣囊的材料有醫用橡膠指套[5]及乳膠氣球[6]，其材質和形狀的不同對實驗結果均有較大的影響，因此本實驗通過對比橡膠指套、圓形乳膠氣球、長條形乳膠氣球所制備的氣囊，篩選出最適合制作測試氣囊的材料，以期對AWR測試標準化改良起到積極的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠30 只，8周齡，體重(250±5)g，由四川省醫學科學院實驗動物研究所養殖研究室提供[SCXK(川)2013-15]。動物在成都中醫藥大學SPF級實驗動物中心飼養[SYXK(川)2014-021]，晝夜節律12 h/12 h，溫度、濕度及晝夜光線恒定，自由攝食、進水。實驗開始前所有動物適應性喂養7 d。實驗操作過程中按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.2 實驗器材

8F導尿管；5英寸圓形乳膠氣球(Sempertex：ISO 9001:2008)；3英寸長條形乳膠氣球(Sempertex：ISO 9001:2008)；一次性醫用橡膠手套(科邦M7.5，生產許可證號：滬食藥監械生產許20 030 944號)；手術縫合四線(4-0)；自制亞克力大鼠觀察箱(20 cm×8 cm×6 cm)；臺式血壓計(魚躍牌)；數顯游標卡尺(MNT美耐特)；電子秤；數碼相機(Canon EOS 600D)；獸用DR數字X光機(InnoVet)。

1.3 實驗方法

1.3.1 材料制備方法

將三種氣囊材料(醫用橡膠指套選取中指)，在4.5 cm及6 cm處做標記，沿6 cm處剪下，用AB膠粘于8F導尿管前端，外面用醫用膠布固定，于4.5 cm處以4-0手術縫合尼龍線系緊，做成氣囊導管。選用經密閉性測試合格者進行后續實驗。

血壓計改裝方法：將臺式血壓計袖帶拆除，經三通管與球囊導管連接，以AB膠粘牢，剩余一端連接氣囊導尿管開口端(圖1)。

圖1 改裝后的血壓計Fig.1 Appearance of the modified blood pressure meter

1.3.2 實驗設計方案

1)不同氣囊在體外的直徑變化：使用數顯游標卡尺測量一次性醫用橡膠指套、5英寸圓形乳膠氣球、3英寸長條形乳膠氣球改良制成的氣囊在4個壓力值(20、40、60、80 mmHg)下的直徑變化。

2)不同氣囊在結腸內的直徑變化：通過X光對大鼠進行成像，等比例測量一次性醫用橡膠手套、5英寸圓形乳膠氣球、3英寸長條形乳膠氣球改良制成的氣囊在4個壓力值(20、40、60、80 mmHg)下在大鼠結直腸內的直徑變化。

3)不同氣囊對AWR疼痛閾值的影響：將大鼠順序稱重、記錄、編號，隨機分為3組，每組10只，根據AWR評分標準[7]，以出現3分的壓力值作為疼痛閾值[8]，分別測試一次性醫用橡膠手套、5英寸圓形乳膠氣球、3英寸長條形乳膠氣球改良制成的氣囊所對應的壓力值，并對其進行統計分析和比較。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各氣囊直徑與壓力值的關系

醫用橡膠指套所改良的氣囊隨壓力值增大直徑變化突兀且不穩定，且能夠穩定的壓力值最高僅為50 mmHg，繼續充氣，壓力值并不會隨著氣囊的增大而上升，反而下降(圖2)；Sempertex 5英寸圓形氣球直徑隨壓力值增大較為均勻和緩，且最高壓力值可達70 mmHg，之后隨充氣量增加，體積增大，壓力值下降(圖3)；而Sempertex 3英寸長條形氣球最高可以達到140 mmHg，但直徑隨壓力值增加改變微弱(圖4)。血壓計每升高10 mmHg所對應的各氣囊直徑變化見表1。

2.2 各氣囊在大鼠直結腸內的直徑與壓力值的關系

在大鼠體內，醫用橡膠指套所改良的氣囊直徑最大，能夠穩定的壓力值最高為60 mmHg，繼續充氣，水銀柱反而下降，為避免對大鼠結直腸造成損害，未測量繼續充氣后的直徑(圖5)；Sempertex 5英寸圓形氣球所改良的氣囊直徑介于橡膠指套與長條形氣球之間，水銀柱可以穩定在80 mmHg(圖6)；Sempertex3英寸長條形氣球改良氣囊在80 mmHg時水銀柱也可以保持恒定，但在大鼠直腸及降結腸中的直徑隨壓力值增加改變較醫用橡膠指套及圓形氣球差異較小(圖7)。血壓計每升高20 mmHg所對應的各氣囊在大鼠結直腸內直徑變化見表2。

表1 不同氣囊隨壓力值增大直徑變化(mm)

注：(1)橡膠指套；(2)圓形氣球；(3)長條形氣球。

Note.(1)Rubber fingerstall；(2)Round balloon；(3)Long balloon.

表2 不同氣囊在大鼠體內隨壓力值增加直徑變化(cm)

注：(1)橡膠指套；(2)圓形氣球；(3)長條形氣球。

Note.(1)Rubber fingerstall；(2)Round balloon；(3)Long balloon.

注：(A)20 mmHg：氣囊最大直徑19.58 mm；(B)40 mmHg：氣囊最大直徑21.87 mm；(C)50 mmHg：氣囊最大直徑25.10 mm；(D)繼續注氣(36.6 mm)，壓力值降低(46 mmHg)。圖2 橡膠指套直徑Note.(A)20 mmHg：maximum diameter is 19.58 mm；(B)40 mmHg：maximum diameter is 21.87 mm；(C)50 mmHg：maximum diameter is 25.10 mm；(D)Further increase the diameter (36.6 mm), but the pressure value drops (46 mmHg).Fig.2 The diameter of a medical rubber fingerstall

注：(A)20 mmHg：氣囊最大直徑21.78 mm；(B)40 mmHg：氣囊最大直徑23.58 mm；(C)70 mmHg氣囊最大直徑29.86 mm；(D)繼續注氣(36.5 mm)，壓力值降低(60 mmHg)。圖3 圓形氣球直徑Note.(A)20 mmHg：maximum diameter is 21.78 mm；(B)40 mmHg：maximum diameter is 23.58 mm；(C)70 mmHg：maximum diameter is 29.86 mm；(D)Further increase the diameter (36.5 mm), but the pressure value drops (60 mmHg).Fig.3 The diameter of a round balloon

注：(A)20 mmHg：氣囊最大直徑10.09 mm；(B)40 mmHg：氣囊最大直徑10.57 mm；(C)60 mmHg：氣囊最大直徑10.92 mm；(D)140 mmHg：氣囊最大直徑14.18 mm。圖4 長條形氣球直徑Note.(A)20 mmHg：maximum diameter is 10.09 mm；(B)40 mmHg：maximum diameter is 10.57 mm；(C)60 mmHg：maximum diameter is 10.92 mm；(D)140 mmHg：maximum diameter is 14.18 mm.Fig.4 The diameter of a long balloon

2.3 各氣囊對應的直腸擴張疼痛閾值

不同材質及形狀的氣囊所測得的疼痛閾值差異較大。橡膠指套改良氣囊在20 mmHg左右大鼠即出現明顯的疼痛反應，圓形氣球改良氣囊致使大鼠出現明顯疼痛反應的閾值在50 mmHg附近，長條形氣球改良氣囊的疼痛閾值最高，在90 mmHg上下，三種氣囊對應的疼痛閾值之間兩兩比較均P< 0.05，差異有顯著性(表3)。

注：(A)未充氣：氣囊在直腸內最大直徑0.53 cm，在降結腸內最大直徑0.50 cm；(B)20 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.71 cm，在降結腸內最大直徑0.81 cm；(C)40 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.94 cm，在降結腸內最大直徑0.95 cm；(D)60 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑1.02 cm，在降結腸內最大直徑1.09 cm。圖5 橡膠指套在大鼠體內直徑Note.(A)unaerated: the maximum diameter of the balloon in the rectum is 0.53 cm, and that in the descending colon is 0.50 cm；(B)20 mmHg：the maximum balloon diameter in the rectum is 0.71 cm, and that in the descending colon is 0.81 cm；(C)40 mmHg：the maximum balloon diameter in the rectum is 0.94 cm, and that in the descending colon is 0.95 cm；(D)60 mmHg：the maximum balloon diameter in the rectum is 1.02 cm, and that in the descending colon is 1.09 cm.Fig.5 The diameter of medical rubber fingerstll inside the rat body

注：(A)20 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.51 cm，在降結腸內最大直徑0.58 cm；(B)40 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.58 cm，在降結腸內最大直徑0.70 cm；(C)60 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.70 cm，在降結腸內最大直徑0.94 cm；(D)80 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.71 cm，在降結腸內最大直徑1.01 cm。圖6 圓形氣球在大鼠體內直徑Note.(A)20 mmHg：the maximum diameter of the balloon in the rectum is 0.51 cm, and that in the descending colon is 0.58 cm；(B)40 mmHg：the maximum balloon diameter in the rectum is 0.58 cm, and that in the descending colon is 0.70 cm；(C)60 mmHg：the maximum ballon diameter in the rectum is 0.70 cm, and that in the descending colon is 0.94 cm；(D)80 mmHg：the maximum balloon diameter in the rectum is 0.71 cm, and that in the descending colon is 1.01 cm.Fig.6 The diameter of round balloon inside the rat body

注：(A)未充氣：氣囊在直腸內最大直徑0.52 cm，在降結腸內最大直徑0.60 cm；(B)20 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.53 cm，在降結腸內最大直徑0.65 cm；(C)40 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.58 cm，在降結腸內最大直徑0.67 cm；(D)80 mmHg：氣囊在直腸內最大直徑0.67 cm，在降結腸內最大直徑0.83 cm。圖7 長條形氣球在大鼠體內直徑Note.(A)Unaerated: the maximum diameter of the balloon in the rectum is 0.52 cm, and that in the descending colon is 0.60 cm；(B)20 mmHg：the maximum diameter in the rectum is 0.53 cm, and that in the descending colon is 0.65 cm；(C)40 mmHg：the maximum diameter in the rectum is 0.58 cm, and that in the descending colon is 0.67 cm；(D)80 mmHg：the maximum diameter in the rectum is 0.67 cm, and that in the descending colon is 0.83 cm.Fig.7 The diameter of long balloon inside the rat body

疼痛閾值/mmHgPainthreshold橡膠指套Rubberfingerstall21 110±2 355圓形氣球Roundballoon50 630±3 889△長條形氣球Longballoon89 259±3 641△▼

注：與橡膠指套比較，△P< 0.05；與圓形氣球比較，▼P< 0.05。

Note. Compared with the medical rubber finger cover,△P< 0.05;Compared with the round balloon,▼P<0.05.

3 討論

腹壁撤退反射實驗(AWR)是評價慢性內臟痛覺敏化模型的重要指標，然而其測試裝置和方法缺乏統一的標準。目前常用的測量AWR的方法主要有三類：等體積注水法[8]、等體積注氣法[9]以及血壓計恒定壓力值充氣法[10]。通過前期實驗對這三種實驗方法進行驗證，發現注水法在重復測量時無法保證氣囊中的水完全抽取干凈，每次都會殘留無法確定體積的液體，導致實驗出現偏差；注氣法在重復測量時可以避免這一問題，但是在測量過程中由于注射器與導管并非完全密閉，如有漏氣現象實驗者無法及時覺察，同樣會影響實驗結果的準確性；而血壓計法既可以在重復測量時減小誤差，研究者又可以在漏氣時通過觀察水銀柱的下降及時發現，故而在現階段研究中應用最多的為血壓計法，常選用的壓力值分為4級：20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg和80 mmHg[11]。氣囊的選擇則多采用醫用橡膠指套進行改良[12,13]。然而前期實驗發現采用此種方法，血壓計的水銀柱無法恒定的保持在60 mmHg和80 mmHg，而在20 mmHg和40 mmHg不存在這一現象，本研究組更換了乳膠氣球作為改良氣囊，發現可以較好的實現4個等級的壓力值，因此本實驗對不同材質及不同形狀的改良氣囊進行了實驗驗證，以期篩選出滿足該實驗要求的合適的氣囊材料。

由于橡膠材料力學性質復雜，僅在小應變時符合胡克定律，即在線性應變階段，氣球內部的壓強會隨著氣球體積的增大而上升，但當壓強達到其峰值后，氣球內部的壓強反而會隨著氣球體積的增大而減小[14]。峰值后的形變則屬于有限彈性理論(finite elasticity theory)范疇[15]。而AWR實驗中氣囊利用的正是柔性橡膠材料在小應變范圍內的線性表現。研究結果證實醫用橡膠指套改良的氣囊在60 mmHg和80 mmHg時無法恒定的維持實驗所需壓力值，而圓形乳膠氣球和長條形乳膠氣球則可以較好的實現這一點。因此圓形及長條形乳膠氣球較醫用橡膠指套的線性范圍要大，更能滿足實驗的需要。通過體外及體內實驗發現：在線性范圍內氣囊直徑均隨壓力增加而增大，但同等壓力下擴充氣囊時，其直徑增長幅度并不一致，而是呈現出長條形乳膠氣球<圓形乳膠氣球<醫用橡膠指套的變化，這是由于不同柔性橡膠制品的壓強峰值與其形狀及材料均呈相關性，材質越厚其峰值越高，同等材質的情況下，長條形氣球的壓強峰值要高于球形氣球[16]。

腹壁撤退反射實驗所選用的氣囊須同時滿足兩個必要條件：一是線性應變范圍不能過窄，二是在該范圍內直徑隨壓力變化須均衡而明顯。實驗發現橡膠指套改良氣囊線性范圍過窄，無法滿足實驗需求；長條形乳膠氣球改良氣囊線性應變范圍足夠，然而其隨壓力增高發生形變不明顯，因此對應的壓力值下氣囊對大鼠結直腸的刺激差異不顯著，對實驗結果的判定造成困擾；圓球形乳膠氣球則能較好的同時滿足這兩點，并且目前認為正常大鼠腸道擴張壓力≤ 40 mmHg對大鼠為非傷害性刺激，而> 40 mmHg為傷害性刺激[17]。圓形氣球改良氣囊致使大鼠出現明顯疼痛反應的閾值在50 mmHg左右，接近于傷害性刺激的閾值；橡膠指套改良氣囊在20 mmHg左右大鼠即出現明顯的疼痛反應，長條形氣球改良氣囊的疼痛閾值最高，在90 mmHg上下，這些都會對實驗結果造成影響，導致目前的測試方法之間缺少有效的溝通。因此對氣囊進行優化和篩選將對AWR測試方法的標準化研究起到重要的作用。

綜上所述，根據胡克定律及有限彈性理論，在腹壁撤退反射實驗中選擇合適的材質及形狀的橡膠制品是保證實驗結果的準確性及可靠性的關鍵，圓形乳膠氣球由于其具有形變均衡穩定，模型評價特異性高，對大鼠腸道傷害性刺激小等優點，是較為理想的制備測試氣囊的材料。

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(成都中醫藥大學針灸推拿學院，成都 610075)

目的 為腹壁撤退反射實驗優選出恰當的制備氣囊的材料。方法 分別通過數顯游標卡尺及X光圖像對不同氣囊在不同壓力值下的直徑進行測量；并采用3分疼痛閾值作為判斷標準，測試不同氣囊對大鼠造成明顯內臟疼痛時所對應的壓力值。結果 圓形乳膠氣球的直徑隨壓力值增加變化均勻和緩，并且可以滿足實驗中常用的壓力范圍(20～80 mmHg)，其對大鼠造成內臟疼痛的閾值在傷害性刺激值附近，不會對大鼠腸道造成不可逆的損傷。結論 腹壁撤退反射實驗中使用圓形乳膠氣球制備氣囊較為理想。

大鼠；腹壁撤退反射實驗(AWR)；氣囊；標準化

Effect of air bag on the outcome of abdominal withdrawal reflex test

ZHAO Yan， ZHOU Si-yuan*， LUO Dan-ni， CHEN Ying， HUANG Chen
(College of Acupuncture and Massage, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610075,China)

Objective To optimize the preparation of air bag materials for abdominal withdrawal reflex test. Methods To measure the diameters of different pressue-air bags by digital vernier caliper and X ray imaging. Using the pain threshold (3 points) as a criterion to test the pressure values of different air bags in the rats with corresponding visceral pain sensitivity. Results With the increasing pressure, the changes of the diameter of round latex balloon were uniform and gentle, and could meet the pressure range used in the experiment (20～80 mmHg). The threshold of visceral pain in rats was near the nociceptive stimulus value，and would not cause irreversible damage to the rat intestinal tract. Conclusions Air bag made from round latrex ballon is an ideal tool to be used in abdominal withdrawal reflex test in rats.

Rat; Abdominal withdrawal reflex test; Air bag; Standardization

國家自然科學基金資助項目(81503665)；成都中醫藥大學校基金(ZRQN1538)。

趙妍(1982-)，女，主治中醫師，博士研究生，研究方向：針灸的臨床及機制研究。E-mail： 214012310@qq.com

周思遠(1984-)，女，講師，研究方向：針刺治療功能性消化不良的效應與機制研究。E-mail： zzsy6688@qq.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0050-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.010

2016-12-02