尿酸排泄不良型高尿酸血癥動物模型的建立

沈桂芹，于世家

研究報(bào)告

尿酸排泄不良型高尿酸血癥動物模型的建立

沈桂芹1，于世家2*

尿酸是嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，由于人類的尿酸酶基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了突變，缺乏尿酸酶，嘌呤代謝最終大部分以尿酸形式排出，這使得人類的血尿酸水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他哺乳動物。而實(shí)驗(yàn)常用的嚙齒類動物，因?yàn)榫哂心蛩崦福蓪⒛蛩峤到鉃槟蚰宜睾笈懦鲶w外[1]。因此，為了使動物模型與人類的尿酸代謝更加接近，設(shè)法消除或抑制尿酸酶的活性就成為了關(guān)鍵。本實(shí)驗(yàn)研究選擇使用尿酸酶抑制劑與兩種常用的抑制尿酸排泄的藥物(吡嗪酰胺和乙胺丁醇)分別聯(lián)合應(yīng)用，建立尿酸排泄不良型高尿酸血癥的大鼠模型，從而優(yōu)化尿酸排泄不良型高尿酸血癥大鼠模型的建立方法，為臨床針對高尿酸血癥屬于尿酸排泄不良型的患者治療藥物的選擇及研發(fā)提供可靠的、穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)動物模型，也為藥物治療機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠30只，7～8周齡，體重180～220 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司[SCXK(遼)2010-0001]。大鼠購入后，飼養(yǎng)在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[SYXK(遼)2015-0001]。常規(guī)顆粒飼料喂養(yǎng)，12 h晝夜節(jié)律，自由飲水進(jìn)食，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)施過程中嚴(yán)格遵循動物實(shí)驗(yàn)的3R原則[2]。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 試劑

氧嗪酸鉀(potassium oxonate，批號:20160625)，吡嗪酰胺(pyrazinamide，批號:20160629)，均購自北京Solarbio公司；鹽酸乙胺丁醇片(ethambutol hydrochloride，批號：1509351)購自沈陽紅旗制藥有限公司；尿酸(UA)試劑盒(批號:20160606)，肌酐(Cr)試劑盒(批號：20160606)，尿素氮(BUN)試劑盒(批號：20160518)等均購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2.2 儀器

美國Thermo Scientific Multiskan MK3型酶標(biāo)儀，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；湘儀GL-21MC高速冷凍離心機(jī)，購自湘儀儀器生產(chǎn)公司；Sorvall@Biofuge primoR D-37520 Osterode低溫高速離心機(jī)，Thermo Electron Corporation生產(chǎn)；德國IKA T10 Basic ULTRA-TURRAX@高速勻漿機(jī) BS25，購自上海悅豐儀器儀表有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藥物配制

將鹽酸乙胺丁醇藥片壓碎，加生理鹽水配成混懸液(2.5 g/100 mL)[3]。用0.9%氯化鈉注射液加入少量3 mol/L的NaOH[4]調(diào)整pH值至7.4～7.6溶解氧嗪酸鉀(2 g/100 mL)，用0.22 μm孔徑微孔濾膜過濾后備用。用0.9%氯化鈉注射液加入吡嗪酰胺配置成溶液(1.5 g/100 mL)[5、6]。

1.3.2 動物分組

將30只雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，然后采用隨機(jī)數(shù)字法將大鼠隨機(jī)分為三組：正常對照組、模型Ⅰ組、模型Ⅱ組，每組10只大鼠。

1.3.3 干預(yù)因素

正常對照組：經(jīng)口灌胃生理鹽水，1 mL/100 g·d-1；腹腔注射生理鹽水，1 mL/100 g，一日兩次；皮下多點(diǎn)注射生理鹽水，1.25 mL/100 g，一日兩次。

模型I組：經(jīng)口灌胃乙胺丁醇混懸液，1 mL/100 g·d-1；腹腔注射生理鹽水，1 mL/100 g，一日兩次；皮下多點(diǎn)注射氧嗪酸鉀溶液，1.25 mL/100 g，一日兩次。

模型II組：經(jīng)口灌胃生理鹽水，1 mL/100 g·d-1；腹腔注射吡嗪酰胺溶液，1 mL/100 g，一日兩次；皮下多點(diǎn)注射氧嗪酸鉀溶液，1.25 mL/100 g，一日兩次。

1.3.4 標(biāo)本采集及處理

分別于造模前、造模第1周、3周、5周上代謝籠，收集24 h尿、便標(biāo)本。記錄總尿量、總便量。然后留取部分標(biāo)本處理后采用手工法(比色法)[7]檢測尿酸含量。同時經(jīng)球后靜脈叢穿刺采血，分離并收集血清，采用手工法(比色法)檢測血清中尿酸、肌酐、尿素氮、AST、ALT含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，摘取肝臟及腎臟組織，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色，觀察肝臟、腎臟病理改變。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 造模前、后各組大鼠尿酸含量及尿量比較

造模前各組大鼠尿酸含量及尿量檢測結(jié)果顯示：各組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)(見圖1)。

造模后各組大鼠尿酸含量及尿量檢測結(jié)果顯示：造模第1周時，與空白對照組比較，模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠血尿酸水平均明顯升高(P< 0.01)，模型組間比較差異無顯著性(P> 0.05)；隨著造模時間的延長，模型Ⅰ組血尿酸逐漸下降，且差異有顯著性(P< 0.05)，而模型Ⅱ組血尿酸一直保持在高水平，各時間點(diǎn)比較差異無顯著性(P> 0.05)(詳見圖1)。

連續(xù)給藥期間，模型Ⅰ、Ⅱ組大鼠尿液中尿酸濃度出現(xiàn)先升高后降低的變化，但模型Ⅰ組24 h尿量差異無顯著性(P> 0.05)，24 h尿液中尿酸總量也呈現(xiàn)出先升高后降低的變化；模型Ⅱ組24 h尿量出現(xiàn)了逐漸增加的趨勢(P< 0.05)，24 h尿液中尿酸總量變化無顯著性差異(P> 0.05)(詳見圖2～4)。

模型Ⅰ組大鼠便尿酸在連續(xù)給藥第3周和第5周顯著高于造模前和造模第1周(P< 0.01)，而模型Ⅱ組大鼠各時間點(diǎn)糞便中尿酸含量變化無顯著性差異(P> 0.05)(詳見圖5)。

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型Ⅰ組比較，#P<0.05, ##P < 0.01；與造模前比較，△△P< 0.01；與造模1周比較，○P< 0.05，○○P < 0.01。圖1 各組大鼠血清中尿酸含量測定結(jié)果Note. Compared with blank group，*P < 0.05，**P < 0.01； Compared with model groupⅠ，#P<0.05, ##P < 0.01；Compared with before dosing，△△P< 0.01；Compared with dosing for one week，○P< 0.05，○○P < 0.01.Fig.1 Determination of uric acid in serum of rats in each group

注：與空白對照組比較，**P < 0.01；與模型Ⅰ組比較，##P < 0.01；與造模前比較，△△P< 0.01；與造模1周比較，○○P < 0.01；與造模3周比較，▲▲P < 0.01。圖2 各組大鼠尿液中尿酸濃度結(jié)果Note. Compared with blank group，**P < 0.01； Compared with model groupⅠ，##P < 0.01；Compared with before dosing，△△P< 0.01；Compared with dosing for one week，○○P < 0.01；Compared with dosing for three weeks，▲▲P < 0.01.Fig.2 The concentration of uric acid in urine of rats in each group

注：與空白對照組比較，**P < 0.01；與模型Ⅰ組比較，##P < 0.01；與造模前比較，△△P< 0.01；與造模1周比較，○○P < 0.01；與造模3周比較，▲▲P < 0.01。圖3 各組大鼠24 h尿量Note. Compared with blank group，**P < 0.01； Compared with model groupⅠ，##P < 0.01；Compared with before dosing，△△P< 0.01；Compared with dosing for one week，○○P < 0.01；Compared with dosing for three weeks，▲▲P < 0.01.Fig.3 24 hours urine volume of rats in each group

2.2 造模前、后各組大鼠肝、腎功能檢測

造模前后各組大鼠肝、腎功能檢測結(jié)果顯示：各組間比較，差異無顯著性(P> 0.05)。

注：與空白對照組比較，*P < 0.05，**P < 0.01；與模型Ⅰ組比較，##P < 0.01；與造模前比較，△P < 0.05，△△P< 0.01；與造模1周比較，○○P < 0.01；與造模3周比較，▲▲P < 0.01。圖4 各組大鼠24 h尿液中尿酸總量Note. Compared with blank group，*P < 0.05，**P < 0.01； Compared with model groupⅠ， ##P < 0.01；Compared with before dosing，△P < 0.05，△△P< 0.01；Compared with dosing for one week，○○P < 0.01；Compared with dosing for three weeks，▲▲P < 0.01.Fig.4 24-h total urine uric acid in the rats

，

注：與空白對照組比較，**P < 0.01；與模型Ⅰ組比較，##P < 0.01；與造模前比較，△△P< 0.01；與造模1周比較，○○P < 0.01。圖5 各組大鼠24 h糞便中尿酸含量檢測結(jié)果Note. Compared with blank group，**P < 0.01； Compared with modelⅠgroup，##P < 0.01；Compared with before dosing，△△P< 0.01；Compared with dosing for one week，○○P < 0.01.Fig.5 Detection of 24-h uric acid of the rats excreted in feces

2.3 肝、腎組織病理改變

與正常對照組比較，模型Ⅰ組及模型Ⅱ組大鼠肝臟組織病理均未見明顯病理變化，無肝細(xì)胞腫脹、嗜酸性變或壞死匯管區(qū)未見炎癥反應(yīng)，肝血竇間隙正常，模型Ⅰ組偶見脂質(zhì)顆粒沉積，見圖6。同時腎臟組織病理顯示腎單位結(jié)構(gòu)較完整，腎小管結(jié)構(gòu)清晰，管腔規(guī)則，未見擴(kuò)張及壞死。模型Ⅰ組偶見個別上皮細(xì)胞水腫，胞漿淡染，均未見炎癥細(xì)胞，見圖7。

3 討論

臨床上根據(jù)血尿酸水平和尿液中尿酸排泄情況，將高尿酸血癥分為[8]尿酸排泄不良型、尿酸生成過多型和混合型。而臨床研究結(jié)果顯示，90%左右的原發(fā)性高尿酸血癥屬于尿酸排泄不良型[9，10]。因此，筆者從臨床疾病分型出發(fā)，設(shè)計(jì)建立尿酸排泄不良型高尿酸血癥動物模型。在以往研究中，氧嗪酸鉀的劑量從50 mg/kg[11]到600 mg/kg[12]均可成功建模，而皮下注射的給藥方式[13]可以使血尿酸升高后持續(xù)更長時間，因此結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究選擇皮下注射氧嗪酸鉀300 mg/kg的給藥方法。而腹腔注射吡嗪酰胺的劑量則主要根據(jù)成人用量[5]換算折合成大鼠用量[6]300 mg/kg的劑量。參考以往相關(guān)文獻(xiàn)[14]，確定灌胃給予乙胺丁醇混懸液250 mg/kg的劑量。

應(yīng)用氧嗪酸鉀+吡嗪酰胺連續(xù)給藥一周可以成功建模。其中血尿酸、24 h尿尿酸總量顯著升高，并且在整個實(shí)驗(yàn)過程中一直保持在同一高水平，而便尿酸總量、肝功能、腎功能在實(shí)驗(yàn)過程中沒有明顯變化，說明此方法建立的高尿酸血癥模型血尿酸平穩(wěn)，腎臟排泄尿酸量恒定，對腸道排泄尿酸幾乎沒有影響，對肝臟及腎臟在短時間內(nèi)沒有損害。無論從尿酸代謝還是高尿酸血癥的形成機(jī)制上，此方法建立的高尿酸血癥動物模型與人類更加接近，是更為理想的尿酸排泄不良型高尿酸血癥大鼠模型的復(fù)制方法。

[1] Wu XW，Muzny DM，Lee CC，et al．Two independent mutational events in the loss of urate oxidase during hominoid evolution [J]．J Mol Evol，1992，34(1)：78-84．

[2] 瞿葉清, 哈惠馨, 郭玉琴,等. 3R原則在醫(yī)學(xué)動物實(shí)驗(yàn)工作中的應(yīng)用[J]. 實(shí)驗(yàn)動物科學(xué), 2010, 27(6):84-85.

[3] 施琬，黃惠珠，李鐘，等．建立高尿酸血癥動物模型實(shí)驗(yàn)研究[J]．新中醫(yī)，2015,47(6)：273-276．

[4] 王凱．高尿酸血癥的代謝組學(xué)研究及尿酸性腎損傷動物模型的構(gòu)建[D]．上海應(yīng)用技術(shù)學(xué)院，2016．

[5] 孟昭亨．痛風(fēng)[M]．北京，北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1997，17．

[6] 施心獻(xiàn)．現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)[M]．北京:人民軍醫(yī)出版社,2000,332-335．

[7] 王玲, 李群. 冠心病患者腸道菌群分布及其與尿酸代謝的關(guān)系分析[J]. 現(xiàn)代消化及介入診療, 2012, 17(6):327-330.

[8] 中華醫(yī)學(xué)會內(nèi)分泌學(xué)分會．高尿酸血癥和痛風(fēng)治療中國專家共識[Z]．中華醫(yī)學(xué)會第十二次全國內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會議，2013．

[9] 中國醫(yī)師協(xié)會心血管內(nèi)科醫(yī)師分會,中國醫(yī)師協(xié)會循證醫(yī)學(xué)專業(yè)委員會.無癥狀高尿酸血癥合并心血管疾病診治建議專家共識[J].中國全科醫(yī)學(xué),2010,13(4):1145-1149。

[10] Dincer HE, Dincer AP, Levinson DJ. Asymptomatic hyperuricemia: to treat or not to treat[J]. Cleveland Clin J Med, 2002, 69(8):594, 597, 600.

[11] 徐立, 時樂. 小鼠代謝性高尿酸血癥模型的復(fù)制方法初探[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 16(1):1-4．

[12] 馬通軍．大鼠高尿酸血癥模型的建立與降尿酸中藥的篩選[D]．天津醫(yī)科大學(xué)，2003．

[13] 徐立, 時樂, 仲文欣. 尿酸酶抑制劑在大鼠急性高尿酸血癥模型復(fù)制中的應(yīng)用[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 19(3):2349-2350.

[14] 熊湘明, 曲竹秋, 賈錫蓮. 大鼠高尿酸血癥腎損害模型的建立[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2005, 15(4):206-209.

(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110032； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽 110032)

目的 探討構(gòu)建尿酸排泄不良型高尿酸血癥大鼠模型的可靠方法，為尿酸排泄不良型高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制的研究及治療方案的優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。方法 采用氧嗪酸鉀(300 mg/kg)分別與吡嗪酰胺(300 mg/kg)、乙胺丁醇(250 mg/kg)聯(lián)合造模。連續(xù)給藥1周、3周、5周，檢測大鼠血、尿、便中尿酸水平，同時檢測肝、腎功能，并進(jìn)行組織學(xué)病理切片觀察。結(jié)果 氧嗪酸鉀與乙胺丁醇聯(lián)合造模組大鼠血尿酸出現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，而氧嗪酸鉀與吡嗪酰胺聯(lián)合造模組在連續(xù)給藥期間血尿酸和尿液中尿酸升高平穩(wěn)。兩種方法對肝臟、腎臟均無明顯損害。結(jié)論 氧嗪酸鉀與吡嗪酰胺聯(lián)合能有效建立尿酸排泄不良型高尿酸血癥大鼠模型，且模型穩(wěn)定性好，其發(fā)病過程更符合臨床尿酸排泄不良型高尿酸血癥的病程。

高尿酸血癥；氧嗪酸鉀；吡嗪酰胺；乙胺丁醇；大鼠動物模型

Establishment of a rat model of hyperuricemia associated with uric acid
excretion disorder

SHEN Gui-qin1， YU Shi-jia2*
(1.Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China； 2.Affiliate Hospital of Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032)

Objective To explore a reliable method to establish a rat model of hyperuricemia associated with abnormal uric acid excretion, and to lay the foundation for the study of pathogenesis of uric acid excretion disorder and the optimization of the treatment plan. Methods The models were established respectively by potasium oxonate(300 mg/kg) with pyrazinamide (300 mg/kg) or ethambutol(250 mg/kg). Continuous dosing for 1, 3 and 5 weeks, to determine the content of uric acid in rat blood, urine, and stool, the function of liver and kidney was detected and pathological examination was performed. Results The blood uric acid in the potasium oxonate and ethambutol group was increased first and then decreased, while in the potasium oxonate and pyrazinamide group were increased steadily and the excretion of uric acid in urine was stable during the continuous administration. The two methods showed no harmful effect on the liver and kidney function. Conclusions A stable rat model of hyperuricemia associated with uric acid excretion disorder can be effectively established by potassium oxonate and pyrazinamide, exhibiting similar manifestations of clinical hyperuricemia and uric acid excretion disorder.

Hyperuricemia; Potassium oxonate; Pyrazinamide; Ethambutol; Rat model

遼寧省衛(wèi)計(jì)委資助項(xiàng)目(LNCCC-D54-2015)；沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目(F15-139-9-39)。

沈桂芹(1981-)，女，主治醫(yī)師，博士研究生，研究方向：內(nèi)分泌相關(guān)疾病中西醫(yī)治療。E-mail: 108172067@qq.com

于世家(1957-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：內(nèi)分泌相關(guān)疾病中西醫(yī)治療。E-mail: lnsgq2010@163.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0055-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.011

2016-11-28