肝癌人源腫瘤異種移植模型構建及初步應用

黃 昊，李寶亮，楊星九，李夢媛，朱瑞敏，胡娟娟，韋榮飛，李克娟， 蔣 力，高 苒*

研究報告

肝癌人源腫瘤異種移植模型構建及初步應用

黃 昊1#，李寶亮2#，楊星九1，李夢媛1，朱瑞敏1，胡娟娟1，韋榮飛1，李克娟1， 蔣 力2*，高 苒1*

人源腫瘤組織異種移植模型(patient-derived xenograft models，PDX)是指將病人的新鮮腫瘤組織或腫瘤細胞通過原位或異位等方式移植到免疫缺陷小鼠體內，依靠小鼠提供的環境生長的一種異種移植模型[1]。這種模型保留了原代腫瘤的微環境和組織病理學及遺傳學特征，對于篩選抗癌藥物以及預測患者療效、毒副作用、吸收程度等具有重要意義[2]。此外，PDX模型可以保留原代病人腫瘤的特性，可以作為活體腫瘤用于保存和傳代，為腫瘤學研究提供非常寶貴的研究標本。

肝癌是我國高發的，危害極大的惡性腫瘤，發病率和死亡率排名分別位居第三和第二位[3]。雖然近些年治療手段的不斷進步，但肝癌患者的總體生存率依然不高，原因在于肝癌患者早期診斷發現困難，多數患者在就診時已為晚期，失去手術的機會，即使行手術治療，術后復發率較高，且缺乏有效的復發治療手段。因此，尋找對晚期肝癌和復發性肝癌有效的治療手段，對延長肝癌患者的生存具有重要意義。

索拉非尼是一種新型多靶點抗腫瘤藥物，可通過阻斷由RAF/MEK/ERK介導的細胞信號傳導通路而直接抑制腫瘤細胞的增殖，還可通過抑制VEGF和血小板衍生生長因子(PDGF)受體而阻斷腫瘤新生血管的形成,間接地抑制腫瘤細胞的生長，具有雙重的抗腫瘤作用[4]。索拉非尼作為肝癌中唯一被證實可用的分子靶向藥，但其有效率仍不及50%，一半的患者對索拉非尼不敏感導致整體療效欠佳，并且承受藥物不良反應及巨大的經濟負擔[5, 6]。肝癌PDX模型保持了來源腫瘤的生物學特性，給篩選索拉非尼耐藥病例提供較為合適的動物模型，為肝癌的精準治療提供臨床前研究平臺。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及標本

5周齡SPF級雄性NCG小鼠60只，體重22 g，用于構建PDX模型，購自南京大學-南京生物醫藥研究院[SCXK(蘇)2015-0001]；5周齡SPF級雄性BALB/C裸鼠15只，體重16 g，用于PDX模型的藥效評價，購自北京華阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0009]，NCG小鼠和BALB/C裸鼠均飼養于中國醫學科學院醫學實驗動物研究所屏障環境動物房[SYXK(京)2015-0035]。所有肝癌腫瘤標本來自首都醫科大學附屬北京地壇醫院，所有動物實驗通過了中國醫學科學院醫學實驗動物研究所倫理委員會的批準[GR16002]。

藥敏評價患者病例資料：患者男，44歲，主因“發現HbsAg(+)13年，發現肝占位性病變12 d。”由門診以“原發性肝癌”于2016年7月收入院。2003年發現HbsAg(+)，有肝功能異常，間斷給予保肝治療。2013年進展到肝硬化階段，2015年11月腹部MR未見明確占位改變，2016年7月腹部MR提示肝右葉下段占位性病變，2.5 cm，T1呈低信號，T2呈高信號，腹部增強CT提示肝右葉下段見不規則低密度影，邊界不清，增強掃描動脈期未見明顯異常強化，門脈期呈低密度影，延遲期病變體積減小，考慮為原發性肝癌可能性大，入院后完善檢查評估，并于2016年7月行肝右葉部分切除術、膽囊切除術及PDX模型制作，術后病理回報：肝細胞癌，中-低分化，部分細胞呈膽管細胞樣分化，慢性膽囊炎。恢復順利出院，2016年8月開始持續口服索拉非尼，每次0.4 g(2×0.2 g)，每日兩次，溫開水吞服。2017年1月和2月分別發現肝S7段占位及肝右葉占位，分別給予肝癌射頻消融術及肝癌TACE(transcatheter arterial chemoembolization)術，介入后復查PET-CT發現腹腔淋巴結轉移，索拉非尼療效評價結果為疾病進展(progressive disease, PD)。

1.2 主要試劑

RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司；戊巴比妥鈉購自美國Sigma公司；5-氟尿嘧啶0.25 g/10 mL購自天津金耀氨基酸有限公司；甲磺酸索拉非尼片(簡稱索拉非尼)購自德國拜耳公司；腫瘤組織解離試劑盒(130-095-929)購自德國美天旎生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 人肝癌PDX模型的建立方法

臨床肝癌患者手術切除組織標本離體后立即放入含20%胎牛血清的4℃培養基中，2 h內轉移至動物房生物安全柜內，取部分組織10%中性甲醛溶液固定，剩余部分切成2 mm×2 mm×2 mm小塊。NCG小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液，麻醉劑量為60 mg/kg，腹股溝處備皮，碘伏消毒，開3 mm左右切口，套管針皮下接種移植，手術切口使用5-0可吸收線縫合，小鼠保溫蘇醒后放入籠內。每周觀察小鼠皮下移植瘤的生長情況，首次生長的腫瘤為P1代。待腫瘤直徑達1 cm時，進行組織傳代，脫臼處死小鼠，剝離腫瘤組織，采用皮下移植方法進行傳代，步驟如前。皮下傳代至第三代時，取部分腫瘤組織中性甲醛固定，HE染色與患者腫瘤組織比較，凍存部分P3代腫瘤備用，包括組織塊和組織懸液。

1.3.2 PDX模型生長曲線

皮下接種移植的腫瘤，每周定期測量腫瘤最長瘤徑(a)和最短瘤徑(b)，計算腫瘤體積，腫瘤體積(V)=1/2×a×b2，繪制腫瘤生長曲線。待腫瘤長徑達1 cm進行傳代。

1.3.3 肝癌PDX模型腫瘤組織單細胞懸液制備及造模

P3代PDX腫瘤組織長徑達1 cm時，剝離腫瘤組織，按腫瘤組織解離試劑盒操作流程，獲得腫瘤單細胞懸液，活細胞計數后調整細胞濃度為2×107個細胞每毫升，皮下接種100 μL，制作肝癌模型。

1.3.4 動物分組、給藥及觀察指標

動物分組：肝癌模型建立后一周，將小鼠按瘤體體積大小隨機分為對照組、5-氟尿嘧啶組和索拉非尼組，每組5只。

給藥方式：5-氟尿嘧啶組：尾側靜脈注射，25 mg/kg，隔日一次，連續治療兩周；索拉非尼組：灌胃，30 mg/kg，每日一次，連續治療兩周，對照組：不用藥物干預。

觀察指標：隔日觀察腫瘤體積及小鼠體重變化，繪制生長曲線。藥物干預治療4周后，脫臼處死小鼠，剝離腫瘤組織稱重，統計瘤重及抑制率(inhibition rate,IR)。抑制率=(對照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對照組平均瘤重×100%。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 肝癌PDX模型的建立

本研究共移植2016年7月至2017年2月的18例臨床肝癌組織標本，其中有6例標本(編號為LC-3，LC-7，LC-8，LC-9，LC-13和LC14)成瘤，P1代成瘤時間平均97 d(50～155 d)，P1代成瘤的病例信息如表1所示。P1代腫瘤直徑達1 cm時，進行組織傳代，NCG小鼠皮下移植直至P3代。

2.2 PDX腫瘤組織與患者腫瘤組織病理形態比較

將肝癌患者腫瘤組織及成瘤后PDX模型腫瘤組織使用10%中性甲醛固定、石蠟包埋、組織切片后進行HE染色，光鏡下觀察腫瘤組織的結構特征，結果如圖1，PDX模型腫瘤較好的保持了原發腫瘤的結構特征，二者具有較好的相似性。

2.3 PDX模型腫瘤生長曲線

各代腫瘤組織接種NCG小鼠皮下后，每周監測計算腫瘤體積，隨著時間的延長，腫瘤體積增大，其生長特性符合腫瘤增殖的生物學特性。圖2選用的是LC-3肝癌PDX模型P1，P2和P3的兩個腫瘤的生長曲線(圖2A，2B和2C)，隨著代次的增加，PDX成瘤時間隨之減少(圖2D)。

2.4 LC-3肝癌PDX模型的藥效學評價

我們對LC-3肝癌PDX模型進行藥效學評價，臨床使用索拉非尼同步治療患者，定期復查患者情況，LC-3患者術后6個月出現復發，且伴腹腔淋巴結轉移，索拉非尼療效評定為疾病進展(PD)，與PDX模型的藥效學評價結果相似。治療組在給藥兩周后開始出現抑制現象(圖3A)；在治療過程中，小鼠體重變化無明顯差別(圖3B)；實驗結束時，索拉非尼組抑瘤率約29.6%，但瘤重比較差異無統計學意義，陽性對照組5-氟尿嘧啶抑瘤率達63.7%，瘤重差異有顯著性(P< 0.01)(圖3C、3D)。PDX模型體內實驗結果與臨床治療結果相同，索拉非尼對LC-3患者的療效不佳，即LC-3患者對索拉非尼存在先天耐藥，其藥敏實驗結果能夠反應體內原代腫瘤的藥敏療效，對于篩選抗癌藥物以及預測患者療效等具有重要意義。

表1 肝癌相關PDX模型的病例信息

注：P0表示原代腫瘤組織；P1表示第一代PDX組織。圖1 肝癌PDX腫瘤組織于患者腫瘤組織HE染色Note. P0, the primary tumor tissue；P1, the first generation of PDX tissues.Fig.1 Histology of PDX tumor tissues and human tumor tissues. HE staining

注：(A)P1代腫瘤生長曲線；(B)P2代腫瘤生長曲線；(C)P3代腫瘤生長曲線；(D)不同代次成瘤時間柱狀圖；1#、2#分別代表各代生長的兩個腫瘤。圖2 LC-3肝癌PDX模型的生長特點Note. (A) The growth curve of P1 tumor; (B) The growth curve of P2 tumor; (C) The growth curve of P3 tumor; (D) The histogram of tumor formation time in different generation; 1# and 2# represent two tumors of each generation.Fig.2 Growth characteristics of the LC-3 PDX model

注：(A)腫瘤體積生長曲線圖；(B)小鼠體重變化圖；(C)剝離腫瘤大小比較圖；(D)腫瘤重量量化圖；與對照組比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖3 LC-3肝癌PDX模型的藥效學評價Note. (A) Tumor volume growth curve; (B) Mouse body weight curve; (C) Peeled tumor size comparison chart; (D) Tumor weight quantification diagram; Compared with the control group,*P < 0.05,**P< 0.01.Fig.3 Pharmacodynamic evaluation of the LC-3 PDX model

3 討論

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，雖然由于血清甲胎蛋白的臨床應用和各種影像學技術的進步，使肝癌能夠在無癥狀和體征的亞臨床期做出診斷，加之外科手術技術的成熟，以及各種局部治療等非手術治療方法的發展，使肝癌的預后較過去有了明顯提高，但是整體生存期依然有限[7, 8]，因此，研究開發療效好，毒副作用小及不易產生耐受性的新的治療方案，對延長肝癌患者生存有重要意義。

分子靶向藥在腫瘤治療中的應用越來越多，索拉菲尼也被證實在肝癌中有效，提示分子靶向藥物可能是治療肝癌的新方法。但是目前進入肝癌臨床試驗的靶向藥物中，除了索拉菲尼以外，其余全部被證實在總體人群中無效。即使是索拉菲尼，在臨床應用中同樣有約50%的患者無效，但是我們無法在用藥之前判斷索拉菲尼的療效。索拉菲尼作為唯一應用于肝癌臨床治療的靶向藥物，約一半患者則對索拉菲尼不敏感，使得索拉菲尼的整體療效欠佳，并使得一半患者承受藥物不良反應帶來的痛苦和巨大的經濟負擔。而在索拉菲尼耐藥研究中，受限于體內外腫瘤模型的限制，使得索拉菲尼耐藥機制和標志物仍不清楚。因此，肝癌缺乏有效的分子靶向藥物和用來指導靶向藥物治療的生物標志物或者分子分型。

PDX模型是目前被認為最接近臨床患者的藥物篩選模型。一般PDX模型構建選用高度免疫缺陷的小鼠，以排除機體免疫反應，此外PDX模型根據移植部位主要分為皮下移植、腎包膜下移植和原位移植三種，但模型構建的成功率會隨著組織移植部位、鼠種等不同而差異較大[9-11]。肝癌PDX模型和其對臨床患者腫瘤的代表性報道相對較少，其應用價值值得探討，因此本研究通過皮下接種方式共移植18例臨床肝癌組織標本，其中有6例成瘤，成瘤率為33.3%，P1代成瘤時間平均97 d，隨著代次的增加，PDX成瘤時間隨之減少。PDX模型腫瘤在傳代過程中較好的保持了原發腫瘤的組織形態及結構特征，且移植腫瘤在體內的生長特性符合腫瘤增殖的生物學特性。

PDX模型構建的成功率與腫瘤類型、腫瘤的惡性程度、組織中腫瘤細胞比例、組織離體時間、受體鼠、操作技術、移植部位、飼養環境等多種因素相關[2]。本項目中肝癌PDX模型構建成功率為33.3%，其低成功率可能與肝癌的組織類型或組織中的癌細胞比例相關，我們在相同條件下進行的結直腸癌PDX模型的構建成功率可達90%以上，據文獻報道結直腸癌(64%～89%)與胰腺癌(62%)均具有較高的移植率，但乳腺癌(13%～27%)則相對較低[12]；另外，低成功率可能與移植部位有關，原位或腎包膜移植可能會提高成功率。

雖然PDX模型能夠模擬原發腫瘤的組織病理學、基因組結構以及藥敏反應，但PDX模型依然不能完全模擬原發腫瘤的體內微環境。PDX模型腫瘤的克隆型分布與原發腫瘤不同，基因突變頻率表明克隆選擇在初期移植過程中比傳代步驟中發生的更加頻繁，且克隆選擇在同一類型腫瘤不同樣本中仍然不同[13]。作為克隆選擇的結果，PDX腫瘤中更具有侵略性的腫瘤克隆成為主導，基因組和轉錄組數據結果表明PDX模型腫瘤與轉移及復發病灶更為相似，與原發灶腫瘤差別較大[14]。因此，PDX模型的應用更適用一線治療失敗、腫瘤復發或轉移的患者。

本研究中我們對一例肝癌患者進行了前瞻性研究，患者手術切除腫瘤的同時制作PDX模型，患者術后接受索拉非尼單藥治療，定期復查，患者術后6個月出現復發，且伴腹腔淋巴結轉移，索拉非尼療效評定為疾病進展，與建成的PDX模型的藥效學評價結果相似，提示其對索拉非尼存在先天耐受，從而導致索拉非尼的療效不佳。肝癌PDX模型是目前為止最為接近臨床研究的相關腫瘤模型，這種模擬人腫瘤特異性的模型對腫瘤臨床前評估、治療和預后具有重要的轉化意義，有望為腫瘤患者個體化治療帶來新突破。

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(1.中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京協和醫學院比較醫學中心，北京 100021； 2.首都醫科大學附屬北京地壇醫院，北京 100015)

目的 建立肝癌人源腫瘤異種移植(patient-derived xenografts，PDX)模型，探討其在肝癌精準醫療中的作用。方法 取臨床肝癌新鮮手術切除標本，NCG小鼠皮下接種腫瘤組織建立PDX模型，HE染色比較移植腫瘤組織與患者腫瘤組織形態結構的一致性。將成功傳至第三代的PDX模型制備腫瘤細胞懸液，BALB/c裸鼠皮下接種制作肝癌移植瘤模型15只，成瘤后隨機分為5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)組、索拉非尼(sorafenib)組和陰性對照組，每組5只。定期監測各組荷瘤小鼠腫瘤體積和重量，根據瘤重計算抑瘤率，評估療效。結果 本研究共建成肝癌PDX模型6例，成功率為33.3%(6/18)，模型較好的保持了原發腫瘤的特征。1例PDX模型中，5-FU與索拉非尼組腫瘤抑瘤率分別為63.7%和29.6%，5-FU組抑瘤率比較差異有顯著性(P< 0.05)，索拉非尼組抑瘤率比較差異無統計學意義，與臨床結果相符。結論 肝癌PDX模型保持了患者腫瘤組織的組織形態，可以適用于肝癌患者的精準醫療。

人源性腫瘤異種移植模型；肝癌；精準醫療

Establishment and application of a patient derived xenograft mouse model of liver cancer

HUANG Hao1#， LI Bao-liang2#， YANG Xing-jiu1， LI Meng-yuan1， ZHU Rui-min1， HU Juan-juan1， WEI Rong-fei1， LI Ke-juan1， Jiang Li2*， GAO Ran1*
(1.Institute of Medical Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021, China； 2.Beijing Ditan Hospital, Capital Medical University, Beijing 100015)

Objective To establish a patient-derived xenografts (PDX) mouse model of liver cancer (LC) and to explore its role in precision medicine. Methods PDX model was established by subcutaneous implantation of tumor tissues in NCG mice. The morphological structure of tumor tissue was exaimed using HE staining. Fifteen BALB/c nude mice were subcutaneously inoculated with tumor cell suspension from the PDX models. The xenograft mice were randomly divided into 5-fluorouracil (5-FU) group, sorafenib group and negative control group. The tumor volume and body weight of the tumor-bearing mice were measured regularly, the tumor inhibition rate was calculated and the curative effect was evaluated. Results The success rate was 33.3% (6/18) in the establishment of liver cancer PDX mouse model, and the model well retained the characteristics of the primary tumor. In one case of PDX mouse model, the tumor inhibition rates of 5-FU and sorafenib group were 63.7% and 29.6%, with a statistically significant differece between them (P< 0.05), and there was no significant difference between the sorafenib group and negative control group, consistent with clinical observation. Conclusions The PDX mouse model of liver cancer can maintain the histological structure of primary tumor, and can be applied to precision medicine for patients with liver cancer.

Patient derived xenograft, PDX; Mouse model; Liver cancer; Precision medicine

中國醫學科學院醫學與健康科技創新工程經費資助(2016-I2M-3-019)；中央級公益性科研院所基本科研業務費(2016ZX310032)；協和青年科研基金資助(3332016078)。

黃昊(1986-)，男，助理研究員，研究方向：腫瘤動物模型的創制及應用。E-mail： huanghao@cnilas.org；李寶亮(1981-)，男，主治醫師，研究方向：消化道腫瘤綜合治療。E-mail： lblzgz@vip.qq.com。# 共同第一作者。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail： gaoran26@hotmail.com；蔣力(1967-)，男，主任醫師，研究方向：肝膽外科及腫瘤外科診治。E-mail： movdush@139.com

R-33

A

1671-7856(2017) 08-0060-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.08.012

2017-05-22