抵抗素上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積聚的作用

羅招凡 李芳萍 程 樺

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120)

抵抗素上調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶表達(dá)對(duì)HepG2 細(xì)胞脂質(zhì)積聚的作用

羅招凡 李芳萍1程 樺1

(中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 廣州 510120)

目的探討抵抗素在棕櫚酸誘導(dǎo)下對(duì)HepG2肝細(xì)胞脂質(zhì)積聚的作用及其對(duì)脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(FAT/CD36)表達(dá)調(diào)控的影響。方法50 ng/ml重組人抵抗素及0.5 mmol/L棕櫚酸孵育HepG2肝細(xì)胞，之后用100 nmol/L胰島素處理，采用實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)1 mRNA水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)胞膜CD36表達(dá)，尼羅紅(Nile Red)染色后激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)胞內(nèi)脂質(zhì)含量。結(jié)果與對(duì)照組相比，抵抗素增加胞膜FAT/CD36含量(P<0.05)，促進(jìn)HepG2細(xì)胞SREBP1 mRNA表達(dá)(P<0.05)，使胞內(nèi)紅色脂肪小滴增多(P<0.05)。結(jié)論在高濃度游離飽和脂肪酸環(huán)境中，抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下通過(guò)上調(diào)HepG2 的CD36 表達(dá)，刺激SREBP1轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致HepG2肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。

抵抗素；胰島素；CD36；脂質(zhì)積聚

脂毒性是指血中游離脂肪酸(FFA)水平升高后，超過(guò)脂肪組織的儲(chǔ)存能力和各組織對(duì)FFA的氧化能力，使過(guò)多的FFA以甘油三酯(TG)等形式在非脂肪組織中過(guò)度沉積而造成對(duì)該組織的損傷。FFA與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān)，脂肪的異位沉積已被認(rèn)為是形成IR的重要因素，而肝臟是最易也是較早發(fā)生脂肪異位沉積的部位。抵抗素參與調(diào)節(jié)糖代謝和導(dǎo)致IR〔1〕。以往人抵抗素對(duì)IR的體外研究多集中在內(nèi)皮細(xì)胞及單核巨噬細(xì)胞，在肝細(xì)胞中的資料相對(duì)較少；而在高FFA環(huán)境中，人抵抗素是否會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂代謝紊亂，是否會(huì)形成肝細(xì)胞內(nèi)脂肪聚積，目前研究資料更是少見(jiàn)。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(FAT/CD36)是一種膜糖蛋白，屬于B 類(lèi)清道夫受體家族，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的多種組織細(xì)胞上，包括肝細(xì)胞、心肌和骨骼肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等，在介導(dǎo)棕櫚酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中起著重要作用〔2〕。本課題擬研究抵抗素在棕櫚酸誘導(dǎo)下對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)積聚的作用，并探討其對(duì)FAT/CD36的表達(dá)調(diào)控。

1 材料與方法

1.1材料及主要試劑 抵抗素(美國(guó)Phoenix.Inc)；棕櫚酸(美國(guó)Sigma公司)；胰島素(Humulin，40 IU/ml，Lily公司)；DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清(BSA)(美國(guó)Gibco公司)；PE鼠抗CD36抗體(美國(guó)BD PharmingenTM公司)；尼羅紅(Nile Red)熒光染料(美國(guó)Sigma公司)；SYBR GreenⅠPCR 通用混合試劑(美國(guó)Applied Biosystems公司)。

1.2方法

1.2.1FFAs的配制 首先在37℃水浴中，將棕櫚酸溶解于無(wú)水乙醇中配制成50 mmol/L的棕櫚酸儲(chǔ)存液。臨用前37℃水浴按0.5%的濃度將BSA溶解于DMEM中，之后將棕櫚酸儲(chǔ)存液與含0.5% BSA(w/v)的DMEM混合并攪動(dòng)1 h配制成500 μmol/L棕櫚酸工作液，按比例加入4% BSA攪動(dòng)10 min混勻，過(guò)濾除菌，4℃儲(chǔ)存。

1.2.2Nile Red熒光染料的配制 取10 mg Nile Red溶解于100 ml丙酮，配制成0.1 mg/ml的Nile Red儲(chǔ)存液，避光保存，臨用時(shí)按1∶100稀釋。

1.2.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組干預(yù) HepG2細(xì)胞用含50 ng/ml抵抗素(res50組)或不含抵抗素(res0組)的低糖DMEM培養(yǎng)液處理24 h，之后用去血清的無(wú)糖DMEM培養(yǎng)液(仍含對(duì)應(yīng)濃度)饑餓3～5 h，然后用含0.5 mmol/L棕櫚酸的低糖DMEM培養(yǎng)液處理16 h，接著用不含胰島素或含100 nmol/L胰島素的低糖DMEM培養(yǎng)液處理2 h，依次收集細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4RNA的提取及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)mRNA水平 收集細(xì)胞，用TRIZOL試劑分離提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為95℃變性10 min，然后95℃15 s，60℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。在PCR反應(yīng)結(jié)束后采用溶解曲線方法驗(yàn)證反應(yīng)的特異性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以管家基因18sRNA的循環(huán)閾值(Ct)作標(biāo)準(zhǔn)化，稱(chēng)為ΔCt，最終各基因的表達(dá)結(jié)果為2-ΔΔCT，其中-ΔΔCT 等于處理組的ΔCt減去對(duì)照組的ΔCT，對(duì)照組的2-ΔΔCT值為1。膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)1基因引物用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)，其特異性及有效性在實(shí)驗(yàn)前均被證實(shí)。引物序列：SREBP1(NM_001005291)前向引物：5′-GCTCCTCCATCAATGACAAAATC-3′，反向引物：5′- TGCAGAAAGCGAATGTAGTCGAT-3′；18sRNA(NR_003286)前向引物：5′-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3′，反向引物：5′-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3′。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜CD36含量 取6孔板中一定量HepG2細(xì)胞(約1×106個(gè)細(xì)胞/ml)，冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后，用4%多聚甲醛1 ml室溫固定40 min，離心去上清，加2 ml PBS重懸洗滌，再用1 ml含5%人血清的PBS重懸細(xì)胞，冰上孵育10 min，800 r/min離心5 min去上清。加入200 μl含0.5%BSA和飽和劑量熒光標(biāo)記抗體(5×105個(gè)細(xì)胞/20 μl抗體)的PBS，避光冰上放置30 min，離心棄上清。加入200 μl 1%多聚甲醛固定，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值，每管計(jì)數(shù)1×104個(gè)細(xì)胞。以流式細(xì)胞儀的配套軟件分析樣品中細(xì)胞的相應(yīng)標(biāo)記陽(yáng)性表達(dá)率。

1.2.6Nile Red染色激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量 取24孔板中HepG2細(xì)胞去培養(yǎng)基，用冰的PBS洗1次，每孔加1 ml 1.5%戊二醛固定5 min之后移去固定液或無(wú)須固定，之后每孔加1 ml PBS，隨即加入10 μl Nile Red染液(0.1 mg/ml)，至少孵育5 min，立即置于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，激發(fā)光波長(zhǎng)450～500 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)>528 nm。正常的HepG2細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)或僅見(jiàn)很少脂肪小滴，而有脂質(zhì)沉積的HepG2細(xì)胞則見(jiàn)紅色或桔紅色的脂肪小滴。激光共聚焦顯微鏡下計(jì)算HepG2細(xì)胞中脂肪小滴所占比例，0、1/4、1/2、3/4或滿(mǎn)視野為界定范圍，評(píng)估脂質(zhì)含量為0～4分，每樣本隨機(jī)計(jì)數(shù)25個(gè)細(xì)胞。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS17.0軟件，實(shí)驗(yàn)用不同批次細(xì)胞重復(fù)3次以上。組間比較采用方差分析(ANOVA)，方差齊性則多組間比較采用Scheffe檢驗(yàn)，非正態(tài)數(shù)據(jù)多組間比較采用多組秩和檢驗(yàn)(K-W)。

2 結(jié) 果

2.1抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響 在激光共聚焦顯微鏡下，正常的HepG2細(xì)胞質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)或僅見(jiàn)很少量脂肪小滴。當(dāng)HepG2細(xì)胞與500 μmol/L棕櫚酸共孵育16 h后，在基礎(chǔ)(res0組脂質(zhì)含量評(píng)分0.68±0.48，res50組為1.48±0.59)及胰島素刺激條件下(res0組脂質(zhì)含量評(píng)分1.80±0.50，res 50組為2.52±0.65，抵抗素使胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加，紅色脂肪小滴增多(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)含量的影響

2.2HepG2細(xì)胞中抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)SREBP1 mRNA表達(dá)的影響 與抵抗素未處理組相比，在基礎(chǔ)組及胰島素刺激狀態(tài)下，抵抗素增加SREBP1 mRNA表達(dá)基礎(chǔ)組：res0組為1，res50組為2.00±0.13；胰島素組：res0組為2，58±0.10，res50組為5.10±0.19(P<0.05)。

2.3抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下對(duì)HepG2細(xì)胞CD36含量的影響 與對(duì)照組(res0組)比較〔基礎(chǔ)組(8.73±1.44)%，胰島素組(16.94±0.65)%〕，抵抗素(50 ng/ml)在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下增加胞膜CD36含量〔基礎(chǔ)組(15.33±1.06)%，胰島素組(23.23±3.56)%〕(P<0.05)。

3 討 論

棕櫚酸屬飽和脂肪酸，具有不易氧化脂解、易貯存的特點(diǎn)，更易導(dǎo)致機(jī)體脂代謝紊亂。人體血清中棕櫚酸占總FFA的34%，是主要的FFA。在正常情況下，血清FFA的濃度為200～600 μmol/L，而在肥胖和糖尿病患者血漿中，F(xiàn)FA濃度可高達(dá)2 000 μmol/L〔3〕。本研究選用500 μmol/L棕櫚酸孵育16 h，可模擬體內(nèi)較高濃度的游離飽和脂肪酸的慢性作用。

SREBP是脂肪合成基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，不但介導(dǎo)膽固醇生物合成的反饋調(diào)節(jié)，而且在脂肪酸合成中起重要的調(diào)節(jié)作用。SREBPs有兩種，分別為SREBP1和SREBP2〔4〕，其中SREBP1選擇性活化脂質(zhì)合成相關(guān)酶基因，如脂肪酸合成酶(FAS)及ACC1等。SREBPs的基因表達(dá)調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平，其受調(diào)控的主要因素包括胰島素〔5〕、葡萄糖〔6〕及多不飽和脂肪酸等〔7〕；此外，瘦素與SREBP1呈負(fù)調(diào)控關(guān)系〔8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在基礎(chǔ)狀態(tài)下，人抵抗素的慢性作用可上調(diào)HepG2細(xì)胞SREBP1 mRNA的表達(dá)，而胰島素刺激條件下可使SREBP1 mRNA表達(dá)顯著增加，表明抵抗素能調(diào)控HepG2細(xì)胞SREBP1的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)脂肪酸的合成。

脂肪酸的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)脂肪酸的攝入起著關(guān)鍵作用，機(jī)體組織攝取脂肪酸主要通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散和蛋白介導(dǎo)兩種方式。短鏈及中鏈脂肪酸可直接通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞膜，而長(zhǎng)鏈脂肪酸如棕櫚酸等攝入需要膜上蛋白質(zhì)如FAT/CD36的介導(dǎo)。Coort等〔9〕研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖和DM前期Zucker大鼠，骨骼肌細(xì)胞攝入長(zhǎng)鏈脂肪酸的速度明顯增加，同時(shí)細(xì)胞膜FAT/CD36的表達(dá)也顯著增強(qiáng)。同樣，肥胖和T2DM患者中也觀察到骨骼肌中長(zhǎng)鏈脂肪酸攝入增加與肌內(nèi)TG堆積密切相關(guān)〔10〕。 FAT/CD36的調(diào)節(jié)涉及基因水平的調(diào)節(jié)、蛋白水平的調(diào)節(jié)及其轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)。Drover等〔11〕的研究發(fā)現(xiàn)，高水平的FFA可促進(jìn)心肌、肝臟等FAT/CD36的基因表達(dá)及轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)。本研究發(fā)現(xiàn)在基礎(chǔ)狀態(tài)下人抵抗素的慢性作用可顯著增加HepG2細(xì)胞膜CD36含量，且在胰島素刺激狀態(tài)下，其胞膜CD36含量進(jìn)一步上升，表明人抵抗素可能通過(guò)上調(diào)胞膜CD36含量，促進(jìn)脂肪酸的攝取。抵抗素能通過(guò)抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)活性顯著減少L6 肌細(xì)胞膜CD36含量，從而減少脂肪酸的攝取，但細(xì)胞總的CD36含量并未發(fā)現(xiàn)改變，說(shuō)明抵抗素對(duì)FAT/CD36的調(diào)節(jié)涉及的可能是轉(zhuǎn)位調(diào)節(jié)。但本研究由于實(shí)驗(yàn)條件所限并未做mRNA定量及免疫印跡實(shí)驗(yàn)，不能說(shuō)明人抵抗素調(diào)節(jié)CD36涉及的是何種水平的調(diào)節(jié)，這有待下一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)完善。肝臟脂質(zhì)異位沉積已被認(rèn)為是形成IR的重要因素。van de Samuel等〔12〕的研究發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪沉積可以導(dǎo)致IR的發(fā)生，其結(jié)果顯示高脂飲食喂養(yǎng)3 d的成年SD大鼠肝組織TG增高至對(duì)照組的3倍，并發(fā)生了肝臟IR。但其確切機(jī)制尚未完全闡明。另外，運(yùn)動(dòng)及某些藥如二甲雙胍、羅格列酮等可通過(guò)促進(jìn)AMPK活化減少SREBP1 mRNA及其下游合成脂質(zhì)靶基因表達(dá)〔13〕。此外，胰島素在提高肝臟脂肪蓄積上也是個(gè)重要的因子，胰島素選擇性刺激肝臟SREBP1c轉(zhuǎn)錄、活化，導(dǎo)致肝脂肪酸合成增加、TG聚積，引起脂肪肝。本研究結(jié)果提示，抵抗素導(dǎo)致胞內(nèi)脂質(zhì)含量增加可能通過(guò)刺激SREBP1c轉(zhuǎn)錄、活化而導(dǎo)致胞內(nèi)脂肪酸合成增加、TG聚積。

綜上所述，在高濃度游離飽和脂肪酸環(huán)境中，抵抗素在基礎(chǔ)及胰島素刺激狀態(tài)下通過(guò)上調(diào)HepG2細(xì)胞膜CD36的表達(dá)，增加細(xì)胞外脂肪酸轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)，刺激SREBP1轉(zhuǎn)錄，造成HepG2肝細(xì)胞脂質(zhì)的異常沉積。

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〔2016-11-15修回〕

(編輯 袁左鳴)

Therecombinanthumanresistinexacerbatesintracellularlipidaccumulationviaup-regulatingCD36inHepG2cells

LUOZhao-Fan,LIFang-Ping,CHENGHua.

DepartmentofClinicalLaboratory,theSunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,Guangdong,China

ObjectiveTo investigate the role of recombinant human resistin (rh-resistin) in the palmitate inducing intracellular lipid accumulation in HepG2 cells and explore the effect of rh-resistin on fatty acid translocase(FAT/CD36).MethodsCells were treated with or without 50 ng/ml rh-resistin in the same condition, followed by serum-starving in glucose-free DMEM for 3～5 hours in the continued presence or absence of rh-resistin. Then cells were incubated with 0.5 mmol/L palmitate for 16 h followed by with or without 100 nmol/L insulin for 2 hours. Sterol regulatory element binding protein1 (SREBP1) mRNA expression levels were determined by real time RT-PCR. The cell surface CD36 content was measured by immunofluorescent flow cytometry analysis. The lipid accumulation in cells was determined by Nile red staining, and images were obtained on a Laser Scanning Confocal Microscope.ResultsIncubation with 0.5 mmol/L palmitate, in both basal and insulin-stimulated conditions, rh-resistin increased cell surface CD36 content, stimulated SREBP1 mRNA expressions and exacerbated intracellular lipid accumulation in HepG2 cells.ConclusionsIn the high concentration of free saturated fatty acid environment, resistin in the basal and insulin could stimulate state by up-regulating HepG2 CD36 expression, stimulate SREBP-1 transcription, leading to HepG2 liver cell intracellular lipid accumulation.

Resistin；Insulin；CD36；Lipid accumulation

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30570886)；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目(教外司留〔2015〕1098號(hào))；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2016A030313345)

羅招凡(1972-)，女，博士，副主任技師，主要從事代謝綜合征與腫瘤的基礎(chǔ)研究。

R589

A

1005-9202(2017)16-3914-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.16.003

1 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院內(nèi)分泌科